利用荧光显微成像系统实时监测细胞内技术方案

本发明专利技术公开了利用荧光显微成像系统实时监测细胞内

【技术实现步骤摘要】
利用荧光显微成像系统实时监测细胞内K
+
变化的方法


[0001]本专利技术涉及生物
，特别涉及利用荧光显微成像系统实时监测细胞内
K
+
变化的方法
。

技术介绍

[0002]监测细胞内
K
+
变化的方法是一种细胞检测的方法，正常生理状态下，细胞内
K
+
浓度约为
150mM
，是生物体细胞内含量最多的阳离子，能够维持细胞内的渗透压，同时对调节酸碱平衡起到重要作用
。K
+
在神经和肌肉收缩的细胞间通讯中起着至关重要的作用，也参与各种糖
、
蛋白质等能量代谢过程，对维持细胞各项生理功能具有重要作用
。K
+
稳态失衡引起细胞功能失常，会导致各种疾病的发生，例如心血管疾病
、
神经系统疾病
、
糖尿病
、
肾脏疾病和癌症等，随着科技的不断发展，人们对于监测细胞内
K
+
变化的方法的要求也越来越高
。
[0003]现有的监测细胞内
K
+
变化的方法在使用时存在一定的弊端，
PBFI(Potassium
‑
binding Benzofuran Isophthalate)
，一种
K
+
敏感的荧光探针，可用来测定细胞的
K
+
水平变化
>。PBFI
在和离子结合后可以产生强烈荧光，激发波长为
340
～
380nm
，发射波长为
500nm。
任何可以检测
fluorescein
的仪器，包括荧光显微镜
、
流式细胞仪
、
荧光分光光度计或荧光酶标仪都可以用于该荧光探针的检测
。
这些方法均不能实时动态监测细胞的动态反应，为此，我们提出利用荧光显微成像系统实时监测细胞内
K
+
变化的方法
。

技术实现思路

[0004]解决的技术问题：针对现有技术的不足，本专利技术提供了利用荧光显微成像系统实时监测细胞内
K
+
变化的方法，将
PBFI
‑
AM
和
TIRFM
相结合，发现一种可以实时动态监测细胞摄取
K
+
的能力，并且能够对其进行相对定量的实验方法，可以有效解决
技术介绍
中的问题
。
[0005]技术方案：为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案为：利用荧光显微成像系统实时监测细胞内
K
+
变化的方法，包括以下操作步骤：
[0006]S1
：细胞培养：将稳定培养的细胞用胰酶消化重悬后，按每平方毫米
1000
个细胞的密度种植到玻底皿中，贴壁培养4小时；
[0007]S2
：洗涤处理：将
PBFI
‑
AM
荧光探针原液用磷酸盐缓冲液
PBS
稀释
1000
倍，使得终浓度为
10
μ
M
，同时加入助扩散剂
Pluronic P
‑
127
，终浓度为
0.04
％，细胞贴壁结束后去除细胞培养液，加入稀释好的
PBFI
‑
AM
，加入的体积以能完全覆盖细胞为宜，置于
37℃
细胞培养箱中避光孵育
30
分钟，用
HBSS
缓冲液洗涤3次，以充分洗涤未进入细胞的
PBFI
‑
AM
荧光探针，整个过程在暗室中进行操作；
[0008]S3
：荧光检测：在玻底皿中加入
190
μ
L HBSS
液进行荧光检测实验；
[0009]S4
：参数设置：打开
TIRFM
‑
EMCCD
机器系统的
NIS
‑
Elements AR
软件，设置好主要参数；
[0010]S5
：显微镜观察检测：在显微镜下选取合适的细胞视野后开始记录细胞荧光值变化，通过荧光值实时动态曲线图观察细胞的荧光值，等荧光值趋于稳定后开始加入
KCl
，通
过荧光值变化观察细胞对
KCl
的动态反应；
[0011]S6
：作图分析：实验结束后将实验数据进行收集，并将收集的数据作图，对实验数据进行分析
。
[0012]作为本申请一种优选的技术方案，所述
S2
步骤中
HBSS
液体配方如下：
CaCl2 1.26mM
，
MgCl2
·
6H2O 0.49Mm
，
MgSO4
·
7H2O 0.41mM
，
KCl 5.33mM
，
KH2PO4 0.44mM
，
NaHCO3 4.16mM
，
NaCl 137.93mM
，
Na2HPO40.34mM
，
Glucose 5.56mM
，
PH
用
NaOH
调至
7.4。
[0013]作为本申请一种优选的技术方案，所述
S4
步骤中主要参数设置如下：
Zyla Settings
参数设置：
Format
：
No Binding
，
Auto Exposure
：
100ms
，
Readout Mode
：
Rolling shutter
，
Readout Rate
：
540MHz
，
Dynamic Range
：
12
‑
bit&Gain 4
，
Sensor Mode
：
Overlap
；
Ti Pad
主要参数设置：
Intensilight
：1，
Filters
：紫色
。
[0014]作为本申请一种优选的技术方案，所述
S6
步骤中实验结束后将实验数据用
NIS
‑
Elements AR Analysis
软件打开后分析，且用
Graph Pad Prism 8.0
软件对数据进行整理作图
本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
利用荧光显微成像系统实时监测细胞内
K
+
变化的方法，其特征在于：包括以下操作步骤：
S1
：细胞培养：将稳定培养的细胞用胰酶消化重悬后，按每平方毫米
1000
个细胞的密度种植到玻底皿中，贴壁培养4小时；
S2
：洗涤处理：将
PBFI
‑
AM
荧光探针原液用磷酸盐缓冲液
PBS
稀释
1000
倍，使得终浓度为
10
μ
M
，同时加入助扩散剂
Pluronic P
‑
127
，终浓度为
0.04
％，细胞贴壁结束后去除细胞培养液，加入稀释好的
PBFI
‑
AM
，加入的体积以能完全覆盖细胞为宜，置于
37℃
细胞培养箱中避光孵育
30
分钟，用
HBSS
缓冲液洗涤3次，以充分洗涤未进入细胞的
PBFI
‑
AM
荧光探针，整个过程在暗室中进行操作；
S3
：荧光检测：在玻底皿中加入
190
μ
L HBSS
液进行荧光检测实验；
S4
：参数设置：打开
TIRFM
‑
EMCCD
机器系统的
NIS
‑
Elements AR
软件，设置好主要参数；
S5
：显微镜观察检测：在显微镜下选取合适的细胞视野后开始记录细胞荧光值变化，通过荧光值实时动态曲线图观察细胞的荧光值，等荧光值趋于稳定后开始加入
KCl
，通过荧光值变化观察细胞对
KCl
的动态反应；
S6
：作图分析：实验结束后将实验数据进行收集，并将收集的数据作图，对实验数据进行分析
。2.
根据权利要求1所述的利用荧光显微成像系统实时监测细胞内
K
+
变化的方法，其特征在于：所述
S2
步骤中
HBSS
液体配方如下：
CaCl2 1.26mM
，
MgCl2
·
6H2O 0.49Mm
，
MgSO4
·
7H2O 0.41mM
，
KCl5.33mM
，
KH2PO4 0.44mM
，
NaHCO3 4.16mM
，
NaCl 137.93mM
，
Na2HPO40.34mM
，
Glucose 5.56mM
，
PH
用
NaOH
...

【专利技术属性】
技术研发人员：高芹芹，徐婷，张美华，孙淼，吉冰玉，李凌君，丁红梅，雷佳惠，邓风盈，
申请(专利权)人：苏州大学附属第一医院，
类型：发明
国别省市：