本发明专利技术公开了间隙连接蛋白及其编码基因在制备逆转肿瘤干细胞恶性表型的药物中的应用；本发明专利技术考察了肿瘤干细胞中间隙连接通讯的功能状态、间隙连接蛋白的表达情况以及其同肿瘤干细胞特殊生物学特性之间的关系，结果显示，同分化肿瘤细胞相比，肿瘤干细胞中存在间隙连接通讯障碍，细胞间未见明显间隙连接样结构，多种间隙连接蛋白表达下调，尤其是间隙连接蛋白４３（Ｃｘ４３）；Ｃｘ４３的表达下调与其编码基因ＧＪＡ１启动子甲基化以及ｍｉｃｒｏＲＮＡ的表达相关；恢复Ｃｘ４３在肿瘤干细胞中的表达，能够显著降低肿瘤干细胞的自我更新能力、成瘤能力和侵袭能力，这与间隙连接通讯功能的部分恢复、Ｅ－钙粘素表达上调以及ＳＤＦ－１／ＣＸＣＲ４下游信号通路（ＡＫＴ和ＥＲＫ１／２）失活有关；提示间隙连接蛋白及其编码基因可用于制备逆转肿瘤干细胞恶性表型的药物。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及间隙连接蛋白及其编码基因在制备逆转肿瘤干细胞恶性表型的药物 中的应用，属于生物医药领域。
技术介绍
恶性肿瘤是严重危害人类健康的高发病率和高致死率疾病。传统肿瘤治疗都是针 对所有的肿瘤细胞，而且认为肿瘤细胞具有功能同质性。近年来，随着肿瘤干细胞(Tumour stem cells,TSC)相继在不同的肿瘤组织中分离成功，有力的证明了肿瘤干细胞的存在，为 深入探讨肿瘤的发生、发展及评价预后等提供了新的理论依据，也为肿瘤治疗带来了新的 思路。越来越多的证据表明，肿瘤细胞具有功能异质性，在肿瘤细胞群体中，只有肿瘤干细 胞亚群才有自我更新、多向分化及成瘤能力，是肿瘤发生、进展和复发的根源。只有杀灭肿 瘤干细胞，才能达到根治肿瘤的目的。因此，肿瘤治疗的关键应是针对肿瘤干细胞的治疗。间隙连接(gap junction, GJ)是细胞间连接方式的一种，由间隙连接蛋白 (connexin, Cx)构成。相邻细胞间通过间隙连接介导的间隙连接通讯(gap junction intercelluar communication,GJIC)进行信息、能量和物质的交换，对细胞的新陈代谢、内 环境稳定、增殖和分化等生理过程起重要的调控作用。在间隙连接蛋白家族中，间隙连接蛋 白43(Cx43)表达最为广泛，对于保持正常的间隙连接通讯功能至关重要。大量研究表明，间隙连接通讯功能缺陷与多种肿瘤的发生和转移密切相关。在肿 瘤形成过程中，间隙连接通讯功能的抑制或缺失使前肿瘤细胞或转化细胞与周围正常细胞 之间的信息传递受阻，失去周围正常细胞的调控而获得自主性生长，进而发展成肿瘤细胞。 肿瘤细胞之间同型间隙连接通讯被破坏在导致肿瘤细胞异质性增加的同时可导致细胞之 间解离，从而促进肿瘤转移，转移能力与间隙连接通讯呈负相关。而间隙连接通讯功能缺陷 与间隙连接蛋白的表达降低或消失密切相关。许多肿瘤细胞如胶质瘤、肺癌、肝癌、乳腺癌、 前列腺癌细胞等均显示相应的间隙连接蛋白表达降低或缺失。应用间隙连接蛋白基因转 染肿瘤细胞，可见间隙连接蛋白表达升高，间隙连接通讯功能恢复，肿瘤生长和转化表型抑 制。因此，间隙连接蛋白及其基因是良好的抗肿瘤药物靶标。但是，上述研究结果均是以肿 瘤细胞为研究对象，而肿瘤干细胞中，间隙连接通讯的功能状态、间隙连接蛋白的表达情况 以及其同肿瘤干细胞特殊的生物学特性之间的关系尚不清楚。
技术实现思路
有鉴于此，为克服现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供间隙连接蛋白及其编 码基因在制备逆转肿瘤干细胞恶性表型的药物中的应用。为达到此目的，在本专利技术的第一方面，提供了间隙连接蛋白在制备逆转肿瘤干细 胞恶性表型的药物中的应用。进一步，所述肿瘤干细胞为胶质瘤干细胞；进一步，所述药物包括间隙连接蛋白和药学上可接受的载体；进一步，所述间隙连接蛋白为间隙连接蛋白43。在本专利技术的第二方面，提供了间隙连接蛋白编码基因在制备逆转肿瘤干细胞恶性 表型的药物中的应用。进一步，所述肿瘤干细胞为胶质瘤干细胞；进一步，所述药物包括间隙连接蛋白编码基因重组表达载体和药学上可接受的载 体；进一步，所述间隙连接蛋白编码基因为间隙连接蛋白43的编码基因GJAl ；进一步，所述间隙连接蛋白编码基因重组表达载体为GJAl基因重组腺病毒，所述 GJAl基因重组腺病毒是将人GJA7基因表达盒插入El区缺失的复制缺陷型腺病毒载体的 El区缺失位置而得到；进一步，所述人GJAl基因表达盒包括启动子、人GJAl基因cDNA和终止子，所述启 动子为CMV，所述终止子为PloyA。本专利技术的有益效果在于本专利技术考察了肿瘤干细胞中间隙连接通讯的功能状态、 间隙连接蛋白的表达情况以及其同肿瘤干细胞特殊的生物学特性之间的关系。结果显示， 同分化肿瘤细胞相比，肿瘤干细胞中存在间隙连接通讯障碍，细胞间未见明显间隙连接样 结构，多种间隙连接蛋白表达下调，尤其是间隙连接蛋白43 ；间隙连接蛋白43的表达下调， 与其编码基因GJAl启动子甲基化以及microRNA的表达相关；恢复间隙连接蛋白43在肿 瘤干细胞中的表达，能够显著降低肿瘤干细胞的自我更新和成瘤能力，同时明显降低肿瘤 干细胞的侵袭能力，这与间隙连接通讯功能的部分恢复、E-钙粘素(E-Cadherin)表达上调 以及SDF-1/CXCR4下游信号通路(AKT和ERK1/2)失活有关。因此，间隙连接蛋白及其编码 基因可用于制备逆转肿瘤干细胞恶性表型的药物，在肿瘤治疗领域具有良好的潜在应用前旦ο附图说明为了使本专利技术的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本专利技术作进 一步的详细描述，其中图1显示了 6例人原代恶性胶质瘤标本Pl P6的切片HE染色结果；其中P1为 男性，45岁，右侧额叶，星形细胞瘤，II级；P2为女性，37岁，左侧颞叶，星形细胞瘤，II级； P3为男性，45岁，右侧额叶，多形性胶质母细胞瘤，IV级；P4为男性，55岁，左侧额叶和颞 叶，多形性胶质母细胞瘤，IV级；P5为男性，55岁，右侧额叶，多形性胶质母细胞瘤，IV级； P6为男性，60岁，左侧顶叶和颞叶，多形性胶质母细胞瘤，IV级。图2显示了肿瘤干细胞及其分化细胞形态的显微鉴定结果；其中A I为不同来 源的肿瘤干细胞球A来源于恶性胶质瘤U87细胞系，B来源于乳腺癌MCF-7细胞系，C来源 于结肠癌HCT116细胞系，D I来源于Pl P6 J 0为不同来源的肿瘤干细胞球的分化 细胞J来源于U87，K来源于MCF-7，L来源于HCTl 16，M 0来源于Pl P3，箭头所指处 为肿瘤干细胞球；光学显微镜放大倍数为200倍。图3显示了肿瘤干细胞标志物的免疫荧光染色鉴定结果；其中A为来源于U87的 肿瘤干细胞球鉴定巢蛋白(nestin)，红色荧光，标尺为20 μ m ;B D为来源于Pl P3的肿瘤干细胞球鉴定nestin，红色荧光，标尺依次为50、30和70 μ m ；E为来源于U87的肿瘤干 细胞球鉴定⑶133，红色荧光，标尺为75 μ m ;F H为来源于Pl P3的肿瘤干细胞球鉴定 ⑶133，红色荧光，标尺依次为50、25和50μπι;Ι为来源于U87的肿瘤干细胞球鉴定八聚体 结合蛋白_4 (0ct4)，绿色荧光，标尺为100 μ m ； J为来源于U87的肿瘤干细胞球鉴定⑶44s， 红色荧光，标尺为25 μ m ;K为来源于MCF-7的肿瘤干细胞球鉴定⑶44s，红色荧光，标尺为 25 μ m ;L为来源于HCTl 16的肿瘤干细胞球鉴定⑶133，红色荧光，标尺为50 μ m ；细胞核为 蓝色荧光。图4显示了肿瘤干细胞分化标志物的免疫荧光染色鉴定结果；其中A E为 来源于U87的肿瘤干细胞球的分化细胞:A鉴定胶质纤维酸性蛋白(GFAP)，红色荧光，标 尺为75 μ m;B鉴定髓鞘碱性蛋白(MBP)，红色荧光，标尺为75ym;C鉴定β-微管蛋白 III ( β -tubulin III)，绿色荧光，标尺为75 μ m ;D鉴定nestin,红色荧光，标尺为10 μ m ； E鉴定⑶133，红色荧光，标尺为25 μ m ;F J为来源于Pl的肿瘤干细胞球的分化细胞F 和G鉴定GFAP，绿色荧光，F标尺为500 μ m, G标尺为75 μ m ;H鉴定MBP，绿本文档来自技高网...
【技术保护点】
间隙连接蛋白在制备逆转肿瘤干细胞恶性表型的药物中的应用。
【技术特征摘要】
...
【专利技术属性】
技术研发人员：余时沧，卞修武，肖华亮，王清良，平轶芳，姜建勇，
申请(专利权)人：中国人民解放军第三军医大学第一附属医院，
类型：发明
国别省市：85
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