一种自噬小体及其提取方法和应用技术

本发明专利技术属于生物药技术领域，具体涉及一种自噬小体及其提取方法和应用

【技术实现步骤摘要】
一种自噬小体及其提取方法和应用


[0001]本专利技术属于生物药
，具体涉及一种自噬小体及其提取方法和应用
。

技术介绍

[0002]铁死亡是一种新近发现的以细胞内游离亚铁离子
(Fe
2+
)
超载和铁依赖性脂质过氧化物积累为特征的调节性细胞死亡形式
。
谷胱甘肽过氧化物酶
4(GPX4)
是一种受内质网
(ER)
应激负向调控的抗氧化酶，可以清除过量的脂质过氧化物，是铁死亡的关键上游调节因子
。
然而，在高糖环境下细胞内
GPX4
蛋白的含量和活性显著下调，导致活性氧
(ROS)
和
Fe
2+
的过量积累，这被认为是触发铁死亡程序的关键因素
。
铁蛋白重链
1(FTH1)
是一种铁存储蛋白，通过可逆存储游离
Fe
2+
，调节细胞内游离
Fe
2+
浓度，降低由生成氧自由基引起的
Fe
2+
毒性
。
但高糖环境下肾小管细胞
(HK
‑2细胞
)
内
FTH1
蛋白表达水平明显下调
。
[0003]自噬小体又名分泌性自噬体
(Secretoryautophagosomes
，
SAPs)
是由分泌性自噬产生的，也属于细胞外囊泡
(EVs)
家族，是一种通过将货物转移到靶细胞的细胞间通信的新模式
。
暴露于压力
、
饥饿，可以通过诱导溶酶体完整性的丧失来增强分泌性自噬和减少降解性自噬
。
近年来对
SAPs
的研究主要集中在阐明其在癌症
、
急性呼吸窘迫综合征
(ARDS)
等疾病发生发展中的作用，为这些疾病的诊断和机制研究提供了一种有前景的策略
。
虽然
SAPs
对某些疾病的病理作用已被描述，但
SAPs
的治疗应用尚未被探索，特别是在铁死亡方面
。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于提供一种自噬小体及其提取方法和应用，所述自噬小体能够显著保护细胞免于铁死亡或者对铁死亡的敏感性减弱
。
[0005]本专利技术提供了一种自噬小体的提取方法，包括以下步骤：将血管内皮细胞在饥饿环境中培养一段时间后，对细胞上清进行低速离心后得到的上清液，再进行高速离心，取沉淀；所述低速离心的离心力为
2000g
，所述高速离心的离心力为
12000g
；
[0006]利用
LC3
标记磁珠与所述沉淀进行孵育，捕获自噬小体
。
[0007]优选的，所述饥饿环境包括不含外泌体胎牛血清的
DMEM
培养基
。
[0008]优选的，将血管内皮细胞在不含外泌体胎牛血清的
DMEM
培养基中培养
48
～
72h。
[0009]优选的，所述低速离心的时间为
10
～
15min
；所述高速离心的时间为
15
～
20min。
[0010]优选的，所述孵育的温度为室温，孵育的时间为
30min
～
2h。
[0011]优选的，所述孵育后还包括利用洗脱液洗脱出所述自噬小体
。
[0012]本专利技术还提供了利用上述提取方法得到的自噬小体
。
[0013]本专利技术还提供了上述自噬小体在制备细胞铁死亡抑制剂中的应用
。
[0014]优选的，所述细胞铁死亡包括高糖条件下诱导产生的细胞铁死亡
。
[0015]本专利技术还提供了一种细胞铁死亡抑制剂，包括上述自噬小体和辅料
。
[0016]有益效果：本专利技术提供了一种新型的抑制铁死亡的细胞外囊泡即自噬小体及其提取方法，具有容易获取
、
对母本细胞无需特殊刺激等优势，适合大规模的提取及应用具有强
大的临床潜在应用价值，为将来抑制细胞铁死亡提供了一种新的策略
。
本专利技术实施例中利用高糖构建了成纤维细胞铁死亡模型，利用所述自噬小体进行验证，证实所述自噬小体能够降低细胞对铁死亡的敏感性，使细胞逃避诱导铁死亡的不良因素
。
附图说明
[0017]图1为本专利技术实施例1中提供的是高糖诱导的成纤维细胞
(HG
‑
HDFs)
内铁离子及
ROS
的表达以及对铁死亡相关基因
GPX4
和
FTH1
表达的影响图；
[0018]图2为本专利技术实施例2中提供自噬小体的表面特异标记蛋白表达结果图；
[0019]图3为本专利技术实施例2中提供的自噬小体的粒径分析图；
[0020]图4为本专利技术实施例2中提供的自噬小体的电镜图；
[0021]图5为本专利技术实施例3中提供的自噬小体作用于铁死亡模型细胞内铁代谢，过氧化以及铁死亡相关蛋白表达的效果评估及分析图；
[0022]图6为
SAPs
对成纤维细胞的细胞活力的影响图；
[0023]图7为
TM
预处理后
SAPs
对内质网应激相关蛋白及对抑制铁死亡的蛋白的影响图；
[0024]图8为
SAPs
作用后对
HG
‑
HDFs
细胞上清中外泌体含量的影响图
。
具体实施方式
[0025]本专利技术提供了一种自噬小体的提取方法，包括以下步骤：将血管内皮细胞在饥饿环境中培养一段时间后，对细胞上清进行低速离心后得到的上清液，再进行高速离心，取沉淀；所述低速离心的离心力为
2000g
，所述高速离心的离心力为
12000g
；
[0026]利用
LC3
标记磁珠与所述沉淀进行孵育，捕获自噬小体
。
[0027]本专利技术将血管内皮细胞在饥饿环境中培养一段时间，所述饥饿环境优选包括不含外泌体胎牛血清的
DMEM
培养基
。
本专利技术实施例中优选将血管内皮细胞在不含外泌体胎牛血清的
DMEM
培养基中培养
48h
，并收集细胞上清
。
本专利技术在饥饿环境下刺激血管内皮细胞中分泌型自噬小体的产生，并对饥饿的自噬小体进行了大量扩增
。
[0028]得到上清后，本专利技术对所述上清进行低速离心，所述低速离心的离心力为
2000g
，所述低速离心的时间优选为
10
～
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种自噬小体的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：将血管内皮细胞在饥饿环境中培养一段时间后，对细胞上清进行低速离心后得到的上清液，再进行高速离心，取沉淀；所述低速离心的离心力为
2000g
，所述高速离心的离心力为
12000g
；利用
LC3
标记磁珠与所述沉淀进行孵育，捕获自噬小体
。2.
根据权利要求1所述提取方法，其特征在于，所述饥饿环境包括不含外泌体胎牛血清的
DMEM
培养基
。3.
根据权利要求2所述提取方法，其特征在于，将血管内皮细胞在不含外泌体胎牛血清的
DMEM
培养基中培养
48
～
72h。4.
根据权利要求1所述提取方法，其特征在于，所述低速离心的时间为
10<...

【专利技术属性】
技术研发人员：张翠萍，崔胜楠，刘熹，田光磊，付小兵，
申请(专利权)人：中国人民解放军总医院，
类型：发明
国别省市：