一种构建用于外源基因定点整合的果蝇品系的方法技术

本发明专利技术公开了一种构建用于外源基因定点整合的果蝇品系的方法

【技术实现步骤摘要】
一种构建用于外源基因定点整合的果蝇品系的方法


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种构建用于外源基因定点整合的果蝇品系的方法
。

技术介绍

[0002]百年来，黑腹果蝇一直是生命科学和生物医学研究中的重要遗传模式生物
。
它体型小
、
易饲养
、
繁殖周期短的特点使其成为理想的遗传研究材料
。
超过
75
％的人类疾病基因在果蝇中有高度同源的对应基因
,
如
Notch、Wnt、Hedgehog
等重要信号通路
。
果蝇功能基因呈现明显的单基因
‑
单表型关系
,
非常适合进行高通量功能基因组学解析
。
因此，建立高效的果蝇转基因技术对于功能基因研究和构建人源化疾病模型具有重要意义
。
[0003]目前，转基因果蝇技术主要依赖以下三种方法：
(1)
利用
P
‑
element
或
PiggyBac
等转座子，通过转座酶随机介导外源基因整合
。(2)
通过同源重组
(
或非同源末端连接
)
途径，实现外源基因精确敲入预设位点；
(3)
采用
phiC31
整合酶系统介导外源基因定点整合
。
然而，这些方法的外源基因整合效率较低，导致转基因果蝇的获得需要投入大量的时间和人力，已成为限制果蝇在生物医学研究中应用的瓶颈
。

技术实现思路

[0004]本专利技术所要解决的技术问题是为了克服现有果蝇转基因技术，如利用
phiC31
重组酶系统进行外源基因整合时存在整合效率较低的缺陷，故本专利技术提供一种构建用于外源基因定点整合的果蝇品系的方法
。
利用本专利技术提供的方法制备的果蝇品系，可以实现外源基因的高效定点整合，该方法可以显著提高果蝇中外源基因的整合效率
。
[0005]本专利技术提供了一种基于铜绿假单胞菌来源的大丝氨酸重组酶
PAI(Pseudomonas aeruginosa Integrase)
的构建用于外源基因定点整合的果蝇品系的方法
。(1)
通过常规遗传操作手段，将优化编码的
PAI
酶
(
含核定位信号
)
的表达单元
(cassette)
整合到果蝇
X
染色体上
(
也可整合到2号或3号染色体
)
，并利用
vasa(
或
nanos)
启动子驱动
PAI
酶在雌性生殖细胞中的特异表达
。(2)
通过常规遗传方法分别将
PAI
酶识别序列
attP(
或
attB)
整合到果蝇2号或3号染色体的特定位点
(
也可整合到
X
染色体上
)。(3)
通过上述果蝇的杂交筛选，获得同时含有
PAI
酶和识别序列
attP(
或
attB)
的双转基因果蝇
(starter line)。(4)
将含有外源基因和
PAI
酶识别序列
attB(
或
attP)
的外源基因供体质粒显微注射入上述
starter line
胚胎，经杂交筛选获得外源基因整合的转基因个体
。(5)
与现有技术中
phiC31
重组酶系统的结果进行比较，以评估本专利技术提供的基于
PAI
的构建用于外源基因定点整合的果蝇品系的方法的整合效率
。
[0006]本专利技术通过以下技术方案解决上述技术问题
。
[0007]本专利技术中，术语“基因组”指的是生物体内全部基因的总和
。
果蝇基因组即为果蝇全部基因的总和，由二倍体的染色体构成
。
果蝇基因组的大小约为
1.4
亿碱基对，其中包含大约
1.3
万个基因
。
[0008]本专利技术中，正常果蝇体细胞为8条染色体，其中6条为常染色体，2条为性染色体，
XY
型性别决定
。
正常果蝇生殖细胞为4条染色体
。
[0009]本专利技术第一方面提供一种构建用于外源基因定点整合的果蝇品系的方法，利用大丝氨酸重组酶
PAI
能特异性识别所述果蝇品系基因组包含的
attP
序列和
/
或
attB
序列，从而将外源基因整合到所述果蝇品系基因组的特定位置中；其中，所述
PAI
的氨基酸序列如
SEQ ID NO:1
所示；和
/
或，所述大丝氨酸重组酶来源于铜绿假单胞菌
(Pseudomonas aeruginosa)。
[0010]本专利技术一些实施方案中，所述果蝇品系包括果蝇细胞或果蝇胚胎；所述果蝇细胞包括体细胞和生殖细胞
。
[0011]本专利技术一些实施方案中，所述果蝇品系的染色体上包含编码所述
PAI
的核苷酸序列
。
[0012]本专利技术一些实施方案中，在所述果蝇品系中导入所述
PAI
或编码所述
PAI
的核苷酸序列使所述果蝇品系中包含所述
PAI
，导入的方式例如为显微注射
。
[0013]本专利技术一些实施方案中，所述果蝇品系基因组上包含一个或多个
attP
序列或
attB
序列
。
[0014]本专利技术一些较佳的实施方案中，所述果蝇品系为黑腹果蝇
(Drosophila melanogaster)。
[0015]本专利技术一些实施方案中，所述
attP
序列具有如
SEQ ID NO:3
所示的核苷酸序列；和
/
或，所述
attB
序列具有如
SEQ ID NO:4
所示的核苷酸序列
。
[0016]本专利技术一些实施方案中，编码所述
PAI
的核苷酸序列以及
PAI
识别的
attP
序列和
/
或
attB
序列位于
X
染色体上
、2
号染色体上或3号染色体上
。
[0017]本专利技术一些具体实施方案中，编码所述
PAI
的核苷酸序列如
SEQ ID NO:2...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种构建用于外源基因定点整合的果蝇品系的方法，其特征在于，利用大丝氨酸重组酶
PAI
特异性识别所述果蝇品系基因组包含的
attP
序列和
/
或
attB
序列，从而将外源基因整合到所述果蝇品系基因组的特定位置中；其中，所述
PAI
的氨基酸序列如
SEQ ID NO:1
所示；和
/
或，所述大丝氨酸重组酶来源于铜绿假单胞菌
(Pseudomonas aeruginosa)。2.
如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述果蝇品系包括果蝇细胞或果蝇胚胎；所述果蝇细胞包括体细胞和生殖细胞；和
/
或，所述果蝇品系的染色体上包含编码所述
PAI
的核苷酸序列；和
/
或，在所述果蝇品系中导入所述
PAI
或编码所述
PAI
的核苷酸序列使所述果蝇品系中包含所述
PAI
，导入的方式例如为显微注射；和
/
或，所述果蝇品系基因组包含一个或多个
attP
序列或
attB
序列；较佳地，所述果蝇品系为黑腹果蝇
(Drosophila melanogaster)。3.
如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述
attP
序列具有如
SEQ ID NO:3
所示的核苷酸序列；和
/
或，所述
attB
序列具有如
SEQ ID NO:4
所示的核苷酸序列
。4.
如权利要求1‑3任一项所述的方法，其特征在于，编码所述
PAI
的核苷酸序列以及
PAI
识别的
attP
序列和
/
或
attB
序列位于
X
染色体上
、2
号染色体上或3号染色体上；较佳地，编码所述
PAI
的核苷酸序列如
SEQ ID NO:2
所示
。5.
如权利要求1‑4任一项所述的方法，其特征在于，将编码所述
PAI
的核苷酸序列整合至果蝇转基因质粒上，获得
PAI
表达质粒，由此所述

【专利技术属性】
技术研发人员：高冠军，史王飞，
申请(专利权)人：上海科技大学，
类型：发明
国别省市：