逆转肾纤维化的新型融合蛋白的制备方法以及活性检测技术

本发明专利技术属于医药生物技术领域，具体涉及基因克隆、外源基因在原核细胞中的表达、目的蛋白质的纯化、抑制ＴＧＦ－β１通路而逆转肾纤维化的新型穿膜融合蛋白，其特征在于：应用ＴＧＦ－β１通路抑制蛋白ＳＡＲＡ，将其与穿膜蛋白结构域（ＰＴＤ）融合在大肠杆菌中获得高效表达，利用硫酸铵盐析和阴阳离子交换的方法对目的蛋白进行纯化，将得到的目的蛋白进行了活性测试。其既具有新型ＴＧＦ－β１通路抑制剂ＳＡＲＡ高效低毒的优点，又能有效的穿过细胞膜和核膜，从而降低ＴＧＦ－β１通路抑制剂的临床用药量，增强其在逆转肾脏纤维化治疗中的作用，可望获得临床治疗肾脏纤维化的新型多肽药。

【技术实现步骤摘要】

【技术保护点】
逆转肾纤维化的新型融合蛋白的制备方法以及活性检测，其特征在于：它包括　　１）合成含酶切位点编码ＰＴＤ－ＳＡＲＡ的基因序列；　　２）ＰＴＤ－ＳＡＲＡ融合蛋白基因的克隆及构建；　　３）重组蛋白的诱导表达；　　４）重组蛋白的纯化；　　５）重组蛋白的体外穿膜活性检测；即重组ＰＴＤ－ＳＡＲＡ穿过ＨＫＣ细胞胞膜和核膜的能力；加入不同剂量的重组ＰＴＤ－ＳＡＲＡ，ＳＡＲＡ和空白对照，检测其在细胞内胞浆和胞核中的表达量；　　６）重组蛋白的体外生物学活性检测：即重组ＰＴＤ－ＳＡＲＡ抑制ＴＧＦ－β１对人肾小管上皮细胞ＨＫＣ转分化的影响；加入不同剂量的重组ＰＴＤ－ＳＡＲＡ，再用ＴＧＦ－β１刺激ＨＫＣ细胞，观察细胞形态和表皮细胞标志物Ｅ－ｃａｄｈｅｒｉｎ的表达以及间皮细胞标志物α－ＳＭＡ表达量；　　７）重组蛋白的体内生物学活性检测：按建立单侧输尿管结扎梗阻模型，以ＰＴＤ－ＳＡＲＡ为受试药物，ＳＡＲＡ、注射用生理盐水为对照药物，以实验结束时肾脏纤维化为检测指标，确定受试药物的逆转纤维化效果；以实验前后大鼠肾脏功能为检测指标，计算血液ＢＵＮ、ＳＣｒ的含量及尿蛋白定量，确定受试药物的逆转肾脏功能的效果。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：黄晨，孙世仁，杜锐，许国双，朱军，张鹏，宋扬，李曼，加慧卫，刘晓渭，王汉民，陈威，
申请(专利权)人：中国人民解放军第四军医大学，
类型：发明
国别省市：87[中国|西安]