欧洲七叶树体细胞胚胎发生和植株再生方法技术

一种用欧洲七叶树的种子胚芽或春季植株萌发的新芽、种子胚芽培养出的叶片和体胚生长半个月后的子叶进行细胞胚胎发生和植株再生的方法，其特征在于：　　　　ａ．用种子的胚芽进行组织培养，胚芽生长和诱导不定芽所用的基本培养基是ＭＳ培养基，附加的植物激素为ＢＡ、ＫＴ、ＺＴ、ＮＡＡ，去除ＢＡ、ＺＴ浓度低于ＮＡＡ的植物激素组合；　　　　ｂ．用春季植株萌发的新芽或种子胚芽培养出的叶片进行组织培养，离体叶片直接器官发生产生不定芽、间接器官发生产生不定芽和体胚发生所用的基本培养基是ＭＳ，附加的植物激素为ＮＡＡ、２，４－Ｄ、ＢＡ、ＺＴ、ＫＴ、ＩＡＡ、ＩＢＡ；　　　　ｃ．用体胚生长半个月后的子叶进行组织培养，所用的基本培养基为ＭＳ，附加的激素为ＮＡＡ、ＩＡＡ、ＫＴ、ＢＡ、ＺＴ和ＴＤＺ。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于林业科学中林木组织培养技术中的细胞胚胎发生和克隆植株再生
技术介绍
七叶树科(Hippocastanaceae)世界现存2属，其中七叶树属(Aesculus L)约有30余种，主要分布于北温带。我国约有10种，主要分布于西南部的亚热带地区，它们都是高大的落叶乔木，通常树高为20～30m，最高可达到45m。其中的七叶树、长柄七叶树、浙江七叶树、云南七叶树、天师栗、日本七叶树等，在我国分布的地域很广，陕西、河南、江苏、浙江等地都有栽培，在甘肃陇东尚存一棵树龄300多年的古树。因气候变迁，现在我国七叶树分布线南移，仅秦岭地区有自然分布在海拔700米以下山地的野生七叶树。欧洲七叶树(Aesculus hippocastanum)是七叶树科七叶树属的一种，欧洲七叶树原产希腊北部和阿尔巴尼亚山区，1926年Kosanin在马其顿东南部发现了欧洲七叶树。欧洲七叶树代表了第三世纪植物群落的残余物种，含沙河流的淤积层腐殖质黏土和温带气候条件是其最好的适生土壤和环境，在凉爽温和的气候带中也能成功地生长。我国的北京、上海、青岛等城市已有引种栽培。欧洲七叶树高大雄伟，干形通直，枝叶扶疏，冠如华盖，叶大而形美，遮荫效果很好。初夏开花时硕大的白色花序矗立于叶簇中，好似华丽的大烛台，蔚为奇观，是世界5大著名观赏树种之一，也是世界四大行道树(悬铃木、椴树、榆、七叶树)之一。在欧、美各国广泛栽作行道树及庭院观赏树，并有许多园艺变种，在建筑前对植、路边列植、或孤植、丛植于草坪、山坡都很合适。如以其它树种做陪衬，则更加雄伟壮丽。台湾著名文学艺术家罗青曾以《七叶树》为名，出版过一本诗集，以七叶树的美丽和旺盛的生命力点燃艺术之火，召唤人们对自然美和艺术美的向往与追求，开拓多元性的艺术视野，在人类艺术地认识世界、审美地体验世界的进程中发挥了积极作用。欧洲七叶树木材色白、面微黄、质柔软细致，虽不耐腐朽，但可供造纸及制作小工艺品和家具等。欧洲七叶树具有很高的医疗药用价值，同属的七叶树用于医药，在我国的古籍中早有记载。我国传统医学中，七叶树种子以“娑罗子”入药，《本草纲目》中记载“娑罗子，甘、温、利气宽中，和胃止痛”，用于“肝胃气痛，脘腹胀满，经前腹痛，乳胀，疳积虫痛，痢疾”，在《通雅》、《本草纲目拾遗》中也有详细记载。近年来，德国、日本的科学家对欧洲七叶树的药用价值进行了详尽的研究，开发生产的注射剂、片剂、栓剂、胶囊等药品已广泛用于临床。应用效果相当满意，具有良好的市场前景。目前国内各地在七叶树的苗木生产中，一般采用传统的播种法进行繁殖，生长速度很慢，一年生的苗木仅可以长到20～40cm。七叶树属种子为顽拗型种子，不耐失水和低温。有关研究证明，去果皮种子自然风干15天就会因失去水分而丧失发芽能力，故不宜久藏。由于七叶树属种子的成熟季节在9月份，直接播种出苗后，幼苗越冬时需要采取防寒措施。况且七叶树的种子较大(平均粒重约16g)，播种时需要较多劳动力，采用带果皮湿沙保藏法，也需要经常检查翻晒，以防受干、霉烂或鼠害。此外，七叶树属结实大小年现象明显，一般周期为3～4年。所有这些都给七叶树的苗木生产带来极大的困难和繁重的工作量。目前国内对欧洲七叶树的研究和引种栽培均很少，有限的文献记载仅限于七叶树的播种育苗、扦插繁殖和生态习性的研究上，对欧洲七叶树的组织培养技术研究尚未见有报道。国外对欧洲七叶树的研究较多(见表1)，据资料记载，1978年Radojevic曾使用欧洲七叶树(Aesculus hippocastanum)的花粉培育出了胚状体并得到完整的花粉植株；1989年使用未成熟胚胎诱导出了体细胞胚胎并获得完整植株。Profumo et al分别于1989年、1990年使用欧洲七叶树种子的胚轴、子叶等外植体成功地诱导出体细胞胚胎；Dameri et al于1986年使用叶片诱导出体细胞胚胎，但目前尚未形成大规模生产。表1欧洲七叶树国外研究现状外植体 结果 作者及年代花粉体胚，植株Radojevic，1978成熟种子的子叶 愈伤组织带有根Profumo et al.，1976，1980胚轴胚性愈伤组织，体胚Profumo et al.，1989成熟种子的子叶 胚性愈伤，体胚，次生体胚 Profumo et al.，1990，1991叶子非胚性愈伤，胚性愈伤，体胚Dameri et al.，1986未成熟胚胎 非胚性愈伤，胚性愈伤，体胚Radojevic，1988器官发生，萌发的胚胎花丝非胚性愈伤，胚性愈伤，体胚Jorgensen，1989，1991未成熟胚珠 胚性愈伤，体胚Radojevic，Marinkovic，1993体胚顶端分生组织 叶簇，芽繁殖，根，植株 Radojevic et al.，1988鉴于欧洲七叶树巨大的药用和观赏价值，国内市场对欧洲七叶树的需求量越来越大，而目前国内欧洲七叶树的引种栽培有限，其繁殖方式仅限于播种，繁殖速度极慢，又极度耗费人力、物力和财力，远远不能满足市场对欧洲七叶树的需要。
技术实现思路
本方法的专利技术目的是进行欧洲七叶树(Aesculus hippocastanum)的体细胞胚胎工程和克隆植株的再生技术研究，寻找适用于欧洲七叶树细胞工程快速繁殖的成熟技术体系，以满足市场对欧洲七叶树的需要。由于种种原因，目前国内极难获得欧洲七叶树的种子，所用实验材料是通过以下过程逐步获得的先采用种子的胚芽繁殖出无菌苗、再采用无菌苗的叶片或种子萌发幼苗的叶片诱导出不定芽和胚状体，并采用胚状体的子叶及萌发体胚的叶片再次诱导出不定芽和胚状体。克服了种源不足的困难，实验材料比较多，可以加快繁殖速度。本专利技术的技术解决方案为采用欧洲七叶树的种子胚芽或春季植株萌发的新芽、种子胚芽培养出的叶片和体胚生长半个月后的子叶进行组织培养，其主要技术特征如下a.用种子的胚芽进行组织培养，胚芽生长和诱导不定芽所用的基本培养基是MS培养基(Murashing and Skoog medium，以下简称MS)，附加的植物激素为6-苄基氨基嘌呤(benzylaminopurine，以下简称为BA)、6-糠氨基嘌呤(6-Furfurylaminopurine，也称为Kinetin，即“激动素”，以下简称为KT)、玉米素(zeatin，以下简称为ZT)，奈乙酸(naphthylene acetic acid，以下简称为NAA)，去除BA、ZT浓度低于NAA的植物激素组合；b.用春季植株萌发的新芽或种子胚芽培养出的叶片进行组织培养，离体叶片直接器官发生产生不定芽、间接器官发生产生不定芽和体胚发生所用的基本培养基是MS，附加的植物激素为NAA、2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-dichlorophenoxyacetic acid，以下简称为2，4-D)、BA、ZT、KT、吲哚乙酸(indole-3-acetic acid，以下简称为IAA)、吲哚丁酸(indolebutyric acid，以下简称IBA)；c.用体胚生长半个月后的子叶进行组织培养，所用的基本培养基为MS，附加的激素为NAA、IAA、KT、BA、ZT和TDZ(thidiazuron即噻重氮苯基脲)等。组织培养全过程中主要使用以下两种基本培养基，其标准配方分别如下1.MS培养基(M本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用欧洲七叶树的种子胚芽或春季植株萌发的新芽、种子胚芽培养出的叶片和体胚生长半个月后的子叶进行细胞胚胎发生和植株再生的方法，其特征在于a.用种子的胚芽进行组织培养，胚芽生长和诱导不定芽所用的基本培养基是MS培养基，附加的植物激素为BA、KT、ZT、NAA，去除BA、ZT浓度低于NAA的植物激素组合；b.用春季植株萌发的新芽或种子胚芽培养出的叶片进行组织培养，离体叶片直接器官发生产生不定芽、间接器官发生产生不定芽和体胚发生所用的基本培养基是MS，附加的植物激素为NAA、2，4-D、BA、ZT、KT、IAA、IBA；c.用体胚生长半个月后的子叶进行组织培养，所用的基本培养基为MS，附加的激素为NAA、IAA、KT、BA、ZT和TDZ。2.如权利要求1.a所述，用欧洲七叶树种子的胚芽进行离体培养和快速繁殖的方法，其特征在于附加激素BA或ZT的最佳浓度为0.6mg/L。3.如权利要求1.b所述，用欧洲七叶树春季植株萌发的幼嫩叶片或种子胚芽培养出的叶片诱导不定芽及体细胞胚胎发生和植株再生的方法，其特征在于直接器官发生产生不定芽时，最佳的附加激素组合和浓度值为ZT2mg/L+NAA0.2mg/L。4.如权利要求1.b所述，用欧洲七叶树春季植株萌发的幼嫩叶片或种子胚芽培养出的叶片诱导不定芽及体细胞胚胎发生和植株再生的方法，其特征在于间接器官发生产生不定芽时，最佳的附加激素组合和浓度值为BA3mg/L+NAA0.2mg/L及ZT2mg/L+NAA0.2mg/L。5.如权利要求1.b所述，用欧洲七叶树春季植株萌发的幼嫩叶片或种子胚芽...

【专利技术属性】
技术研发人员：施季森，吕秀立，
申请(专利权)人：南京林业大学，
类型：发明
国别省市：