一种用于检测SERPINE1基因CpG岛甲基化的引物及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种用于检测SERPINE1基因CpG岛甲基化的引物及其应用，所述引物序列如下：F：5'

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测SERPINE1基因CpG岛甲基化的引物及其应用


[0001]本专利技术涉及肉品质检测
，特别是一种用于检测SERPINE1基因CpG岛甲基化的引物及其应用。

技术介绍

[0002]完全纤溶酶原激活物抑制剂1(SERPINE1)，也称为纤溶酶原激活物抑制剂1型(plasminogen activator inhibitortype 1,PAI
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1)，作为组织纤溶酶原激活物(tPA)和尿激酶(uPA)的抑制剂起作用。SERPINE1基因在此前的研究中发现与猪的肌肉生长和脂肪增加有关，此外一项关于韩牛背最长肌转录组测序的研究中SERPINE1基因被显著富集，表明SERPINE1基因与肉品质密切相关。此前不同嫩度的牦牛背最长肌组织的转录组测序结果显示SERPINE1基因在高嫩度组织中显著富集，同时SERPINE1富集在与肉质嫩度相关的通路中，如“补体和凝血级联通路”、“HIF
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1信号通路”和“糖尿病并发症中的AGE
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RAGE信号通路”，表明SERPINE1基因表达量越高的牦牛肉嫩度也越高。
[0003]现有研究表明，个体发育相关基因和管家基因的启动子区大都含有CpG岛，其序列异常高甲基化可抑制基因转录表达最终引起表现型变化。CpG岛低甲基化可促进染色质与反式作用因子结合，激活基因表达。目前，亚硫酸氢盐测序PCR(Bisulfite sequencing PCR,BSP)已经是一种能检测基因组中特定位点的甲基化情况的成熟技术被广泛使用。辛鹏慧等人采用BSP方法分析成年牛组织间ZAR1基因甲基化差异时，发现牛ZAR1基因的组织选择性表达与其DNA甲基化有关。李雄等人运用BSP测序技术发现，成年牛背最长肌中MyoD1基因启动子甲基化水平显著高于胎牛。
[0004]但是现有技术存在以下缺点：
[0005]牦牛肉的嫩度普遍较低，口感较差，严重影响了牦牛肉的经济价值，制约了当地畜牧业的发展。此前，尚未有与牦牛肉嫩度相关的表观遗传标志物的报道，并且还未有一种体外快速检测牦牛肉嫩度的分子辅助检测方法建立。

技术实现思路

[0006]为了解决上述技术问题，本专利技术提供了一种用于检测SERPINE1基因CpG岛甲基化的引物及其应用。
[0007]为达到上述目的，本专利技术是按照以下技术方案实施的：
[0008]本专利技术的第一个目的是要提供一种用于检测SERPINE1基因CpG岛甲基化的引物，所述引物序列如下：F：5'
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TTTTTAGTG GAGGAAGGGTTATTAT
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3'，R：5'
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AATCAACTCAAAACTACAAATCTCC
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3'。
[0009]本专利技术的第二个目的是要提供一种用于检测SERPINE1基因CpG岛甲基化的引物在牦牛肉嫩度检测中的应用，包括以下步骤：
[0010]S1、从市场上采集生鲜牦牛背最长肌肉样品，提取其DNA样品；
[0011]S2、利用权利要求1所述的引物，对DNA样品进行亚硫酸氢盐测序PCR扩增获得
SERPINE1基因启动子区的CpG岛区域扩增片段，并回收；
[0012]S3、将回收后的SERPINE1基因启动子区的CpG岛区域扩增片段与pMD19
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T Simple Vector(Takara)载体进行连接，将连接后的片段转化进入感受态细胞，得到的菌液全部均匀涂布于含氨苄青霉素的LB筛选平板上，倒置于37℃恒温培养箱内，培养过夜；
[0013]S4、对LB筛选平板上菌液进行阳性克隆的筛选以及Sanger测序；
[0014]S5、甲基化水平分析：每个组织样品至少获得5个阳性克隆，当该组织所有阳性克隆的平均甲基化水平≤40％，则认为该牦牛背最长肌肉质嫩；平均甲基化水平为40％～60％，嫩度一般；平均甲基化水平≥60％，嫩度老；
[0015]进一步地，所述步骤S1中，提取DNA样品的具体步骤为：
[0016](1)取25mg的牦牛背最长肌肉样品液氮研磨，充分粉碎的组织于1.5mL离心管中，加入450μL组织裂解液；
[0017](2)再加入20μL的10mg/mL蛋白酶K，震荡混匀后放置于56℃水浴中消化过夜；
[0018](3)加入饱和酚500μL，震荡混匀10min，在4℃，12000rpm离心10min；
[0019](4)取上清液，加入等体积的饱和酚
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氯仿，震荡混匀10min，4℃，12000rpm离心10min；
[0020](5)取上清液，加入等体积氯仿，震荡混匀10min，4℃，12000rpm离心10min；
[0021](6)取上清液，加入0.2倍体积的醋酸钠，再加入2倍体积的预冷无水乙醇，上下颠倒摇晃至絮状沉淀出现，冰上放置30min左右；
[0022](7)在4℃，12000rpm条件下离心5min，使絮状DNA沉淀于管底，弃乙醇；
[0023](8)用预冷过的75％乙醇洗涤沉淀，在4℃，12000rpm条件下离心5min，弃去乙醇，沉淀置于空气中干燥；
[0024](9)加100μL灭菌超纯水溶解沉淀即得DNA样品。
[0025]进一步地，所述步骤S2的具体步骤为：
[0026]S21、将提取得到的DNA样品采用EZ DNAMethylation
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GoldTM Kit亚硫酸氢盐试剂盒进行修饰：
[0027](1)将20μL DNA样品和130μL CT conversion Reagent放入PCR管中混匀；
[0028](2)进行PCR反应：98℃、10min，64℃、2.5h，4℃保存；
[0029](3)将600μLBinding Buffer加入吸附柱中；
[0030](4)将PCR产物放入吸附柱中，上下颠倒混匀；
[0031](5)12000rpm离心30s，弃去液体；
[0032](6)加入100μL M
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wash，12000rpm离心30s；
[0033](7)加入200μL M
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Desulphonation，室温静置15
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20min，12000rpm离心30s；
[0034](8)加入200μL M
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washBuffer，12000rpm离心30s；
[0035](9)将吸附柱放入新的1.5mL离心管中，10μL M
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Elution Buffer洗脱，12000rpm离心30s，样品于
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20℃冰箱保存；
[0036]S22、亚硫酸氢盐测序PCR扩增及回收：
[0037](1)以经亚硫酸氢盐修饰的DNA样品为模板，使用扩增引物：F：5'
‑
TTTTTAGTGGAGGAAGGGT本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于检测SERPINE1基因CpG岛甲基化的引物，其特征在于：所述引物序列如下：F：5'
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TTTTTAGTGGAGGAAGGGTTATTAT
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3'，R：5'
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AATCAACTCAAAACTACAAATCTCC
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3'。2.一种如权利要求1所述的用于检测SERPINE1基因CpG岛甲基化的引物在牦牛肉嫩度检测中的应用，其特征在于，包括以下步骤：S1、从市场上采集生鲜牦牛背最长肌肉样品，提取其DNA样品；S2、利用权利要求1所述的引物，对DNA样品进行亚硫酸氢盐测序PCR扩增获得SERPINE1基因启动子区的CpG岛区域扩增片段，并回收；S3、将回收后的SERPINE1基因启动子区的CpG岛区域扩增片段与pMD19
‑
T Simple Vector载体进行连接，将连接后的片段转化进入感受态细胞，得到的菌液全部均匀涂布于含氨苄青霉素的LB筛选平板上，倒置于37℃恒温培养箱内，培养过夜；S4、对LB筛选平板上菌液进行阳性克隆的筛选以及Sanger测序；S5、甲基化水平分析：每个组织样品至少获得5个阳性克隆，当该组织所有阳性克隆的平均甲基化水平≤40％，则认为该牦牛背最长肌肉质嫩；平均甲基化水平为40％～60％，嫩度一般；平均甲基化水平≥60％，嫩度老。3.根据权利要求1所述的用于检测SERPINE1基因CpG岛甲基化的引物在牦牛肉嫩度检测中的应用，其特征在于，所述步骤S1中，提取DNA样品的具体步骤为：(1)取25mg的牦牛背最长肌肉样品液氮研磨，充分粉碎的组织于1.5mL离心管中，加入450μL组织裂解液；(2)再加入20μL的10mg/mL蛋白酶K，震荡混匀后放置于56℃水浴中消化过夜；(3)加入饱和酚500μL，震荡混匀10min，在4℃，12000rpm离心10min；(4)取上清液，加入等体积的饱和酚
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氯仿，震荡混匀10min，4℃，12000rpm离心10min；(5)取上清液，加入等体积氯仿，震荡混匀10min，4℃，12000rpm离心10min；(6)取上清液，加入0.2倍体积的醋酸钠，再加入2倍体积的预冷无水乙醇，上下颠倒摇晃至絮状沉淀出现，冰上放置30min左右；(7)在4℃，12000rpm条件下离心5min，使絮状DNA沉淀于管底，弃乙醇；(8)用预冷过的75％乙醇洗涤沉淀，在4℃，12000rpm条件下离心5min，弃去乙醇，沉淀置于空气中干燥；(9)加100μL灭菌超纯水溶解沉淀即得DNA样品。4....

【专利技术属性】
技术研发人员：蔡欣，敬科民，泽让东科，钟金城，张鹏，田园，李雨谦，
申请(专利权)人：西南民族大学，
类型：发明
国别省市：