基于双抗原对ASFV抗体的间接ELISA检测方法技术

本申请属于动物疫病检测技术领域，具体涉及一种针对非洲猪瘟病毒(ASFV)抗体的间接ELISA检测方法。该方法以CP204L基因编码的p30和B602L基因编码的pB602L蛋白为抗原，包括：包被抗原、封闭、加入待检血清进行孵育、检测等步骤。鉴于p30和pB602L在ASFV结构形成中的重要作用，本申请通过制备纯化的重组ASFV p30和pB602L蛋白，并据此建立了一种可以检测ASFV抗体的双抗原间接ELISA方法，初步实验结果表明，所建立的ELISA检测方法灵敏度和特异性较好，可为ASF检测和判定、以及ASF的早期预防奠定良好的技术基础。好的技术基础。

【技术实现步骤摘要】
基于双抗原对ASFV抗体的间接ELISA检测方法


[0001]本申请属于动物疫病检测
，具体涉及一种针对非洲猪瘟病毒抗体的间接
ELISA
检测方法
。

技术介绍

[0002]非洲猪瘟
(African swine fever
，
ASF)
是一种由非洲猪瘟病毒
(African swine fever virus
，
ASFV)
引起的一种急性
、
烈性
、
出血性传染病，由于其传染速度快
、
致死率高，加上尚无有效防治药剂，目前已给各国养猪业造成了巨大的经济损失
。
[0003]ASFV
是一种结构复杂的双链
DNA
病毒，呈正二十面体形态，是
Asfarviridae
科的唯一成员，该病毒毒株基因组介于
174
‑
190kb
之间，含有
150
‑
167
个开放阅读框，编码
150
‑
200
种蛋白
。
由于该病毒结构较为复杂，总体研究仍然较为有限，因此，对于该病毒的防治仍处于基础研究阶段
。
[0004]由于尚无商品化疫苗和药物用于
ASF
的防治，因此早期的检测诊断和预防仍是防控
ASF
的关键
。
现有技术中，实验室用于
ASF
检测方法包括：聚合酶链反应
(PCR)、
环介导等温扩增
(LAMP)、
荧光定量
PCR、
胶体金快速试纸
、
酶联免疫吸附实验
(ELISA)
等多种
。
虽然这些方法多是实验室检测应用，但由于实验仪器昂贵，并不适合大型养猪场等企业的临场快速检测应用，其中，
ELISA
是最常用的特异性抗体检测方法，具有高效
、
快速
、
操作简便等优点
。
因此，开发一种快速简便的
、
且灵敏稳定的
ASFV
抗体检测方法，对于
ASF
的早期防控是具有重要的实际应用意义的
。

技术实现思路

[0005]在基于相关重组蛋白的表达制备，本申请目的在于提供一种基于双抗原间接
ELISA
检测非洲猪瘟病毒抗体的检测方法，从而为
ASF
的早期准确检测奠定良好的技术基础
。
[0006]本申请所采取的技术方案详述如下
。
[0007]一种基于双抗原间接
ELISA
检测
ASFV
抗体的方法，包括如下步骤：
(
一
)
包被抗原以
CP204L
基因编码的
p30
和
B602L
基因编码的
pB602L
蛋白为抗原，将其按比例混合后，包被
96
孔板；包被时，摩尔比计，
p30:pB602L
＝
4:1
；包被时，将抗原溶解于
pH
＝
7.4
的
PBS
缓冲液中制备成浓度为
0.6
μ
g/mL
的包被液，
37℃
包被1小时；
(
二
)
封闭对步骤
(
一
)
中包被后
96
孔板，用含8％的脱脂奶粉的
TBST
缓冲液作为封闭液，
37℃
封闭1小时；
(
三
)
加入待检血清进行孵育加入待检血清，
37℃
孵育1小时；
随后加入酶标二抗
(
稀释度1：
6000)
，孵育
30
分钟；
(
四
)
检测对步骤
(
三
)
中
96
孔板清洗干净后，加入显色液并在室温下
(22℃
左右
)
避光孵育
15min
；最后加入
2M
硫酸终止液
50
μ
L
终止反应，使用酶标仪在
450nm
的波长下测量吸光度；具体应用时，
OD
450nm
临界值为
0.403
；如果待检血清样品的
OD
450nm
值
≥
临界值，则判定待检血清标本为阳性，如果不是，则为阴性
。
[0008]已有研究表明，
CP204L
基因编码的
p30
是一种
ASFV
早期大量表达的结构蛋白，也是
ASFV
中抗原性最强的蛋白之一，可以诱导被感染动物产生大量的中和抗体，因此，
p30
是
ASFV
早期诊断的重要靶标
。B646L
基因编码的
p72
是一种衣壳蛋白，依据其结构特点可将
ASFV
分为
23
种不同的基因型
。pB602L
作为结构蛋白
p72
的分子伴侣，是一种晚期表达的非结构蛋白，在没有
pB602L
的情况下可导致病毒形成异常的“拉链状”结构，而不是正常的正二十面体病毒颗粒结构
。
[0009]鉴于
p30
和
pB602L
在
ASFV
结构形成中的重要作用，本申请通过制备纯化的重组
ASFV p30
和
pB602L
蛋白，并据此建立了一种可以检测
ASFV
抗体的双抗原间接
ELISA
方法，初步实验结果表明，所建立的
ELISA
检测方法灵敏度和特异性较好，可为
ASF
检测和判定
、
以及
ASF
的早期预防奠定良好的技术基础
。
附图说明
[0010]图1为不同毒力菌株的
CP204L
序列的比较；图2为不同毒力菌株
B602L
序列的比较；图3为对所制备重组蛋白
p30
和
pB602L
纯化结果和分析；其中：
(A)
为对
p30
蛋白分析；
(B)
为对
pB602L
蛋白分析；图
(A)、
图
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种基于双抗原间接
ELISA
检测
ASFV
抗体的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
(
一
)
包被抗原以
CP204L
基因编码的
p30
和
B602L
基因编码的
pB602L
蛋白为抗原，将其按比例
(4:1)
混合并溶解于缓冲液后，包被孔板；
(
二
)
封闭对步骤
(
一
)
中包被后孔板，用封闭液进行封闭；
(
三
)
加入待检血清进行孵育加入待检血清后孵育；随后加入酶标二抗孵育；
(
四
)
检测对步骤
(
三
)
中孔板清洗干净后，加入显色液避光反应；最后加入终止液终止反应并测量吸光度；基于待检血清样品的
OD
450nm
值来判定待检血清样品是否为阳性
。2.
如权利要求1所述基于双抗原间接
ELISA
检测
ASFV
抗体的方法，其特征在于，步骤
(
一
)
中，摩尔比计，
p30:pB602L
＝
4:1
；包被时，将抗原溶解于
pH
＝
7.4
的
PBS
缓冲液中制备成浓度为
0.6
...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴亚楠，张改平，周蕾，宋金星，王梦翔，孙俊如，孙卓雅，田盼盼，张二芹，姬鹏超，
申请(专利权)人：河南农业大学，
类型：发明
国别省市：