Reelin蛋白或Reln基因在角膜损伤治疗药物中的应用制造技术

本发明专利技术涉及生物医药技术领域，特别是涉及Reelin蛋白或Reln基因在角膜损伤治疗药物中的应用。本发明专利技术发现了Reelin蛋白能够为角膜上皮细胞的增殖提供更优的角膜缘微环境，在局部敲低表达Reelin蛋白的Reln基因时，角膜损伤后的角膜修复减慢。因此通过提高Reelin蛋白的浓度，可以促进角膜缘干细胞的分化、角膜上皮细胞的增殖与迁移，从而可以有效促进受损角膜的快速修复。快速修复。快速修复。

【技术实现步骤摘要】
Reelin蛋白或Reln基因在角膜损伤治疗药物中的应用


[0001]本专利技术涉及生物医药
，特别涉及Reelin蛋白或表达Reelin蛋白的Reln基因在角膜损伤治疗药物中的应用。

技术介绍

[0002]角膜缘干细胞缺乏(Limbal stem cells deficiency，LSCD)是亟待解决的临床难题。角膜损伤时，角膜局部的细胞外基质(Extracellular matrix，ECM)成分与细胞因子的水平发生改变，激活LSCs扩增和迁移，能够实现角膜上皮生理性愈合。但是严重或持续的角膜损伤往往会导致病理性角膜愈合。常见的如原发性疾病(先天性无虹膜等)与继发性疾病(化学伤、热烧伤、Stevens
‑
Johnson综合征、感染与慢性炎症刺激等)均可引起LSCs功能受限和数量耗竭，即角膜缘干细胞缺乏症。
[0003]当完全性LSCD仅累及单眼或双眼存在LSCD但仍保留部分健康角膜缘时，可通过移植对侧眼或健康角膜缘组织的自体角膜缘上皮干细胞成功重建；对于双眼角膜缘完全破坏的完全性LSCD，可以使用来自已故供者、活体亲属或其他来源的角膜缘组织进行同种异体移植。对于双眼全LSCD或单眼全LSCD且对侧无健康供体眼的患者，同种异体角膜缘干细胞移植是修复角膜表面的为数不多的选择。以上方案虽然在一定条件下可以通过手术移植联合全身或局部免疫抑制使LSCD的眼表恢复稳定，但全球范围内人体角膜供体匮乏，全身免疫抑制副作用和手术高失败率限制了此类型手术的方式；而人工角膜对眼表条件相对严苛的适应症和大量并发症导致的长期效果欠佳限制了LSCD的治疗。
[0004]因此，单纯增加角膜缘干细胞的数量不足以作为LSCD的可靠治疗策略。目前认为角膜缘微环境失衡导致移植细胞存活数量少、自我更新能力差，是失败的重要原因。越来越多的研究发现微环境对于干细胞的存活与功能维持至关重要，恢复LSCs功能的治疗策略不仅在于数量的补充，还在于微环境的重建。
[0005]角膜缘干细胞微环境为临床上治疗LSCD提供了新的思路，目前基于角膜缘微环境理论的治疗手段对轻度LSCD有效，但对中重度LSCD的疗效较差，可能存在发挥重要调节作用的未知细胞成分、组织成分和细胞外基质。因此，寻找并验证潜在的角膜缘微环境重要成分，探究其如何调控角膜缘微环境恢复稳态，促进LSCs内源性再生，维持外源性移植LSCs的活性，成为亟需解决的关键问题。目前角膜缘微环境的研究多数集中于血管和神经，两者为LSCs的生长提供大量生长因子和营养成分，是角膜缘干细胞微环境的重要组成。然而目前淋巴管系统对于角膜缘微环境的作用尚不明确，尚未将其定义为角膜缘微环境的组成成分。有研究团队通过单细胞测序分析验证，在人和小鼠的角膜缘组织中分离到传统方法未能捕获的几个罕见细胞群，其中包括淋巴管内皮细胞群，因此其是否参与角膜缘微环境组成和具体作用机制值得进一步研究。

技术实现思路

[0006]本专利技术证明了角膜缘的淋巴管内皮细胞表达并分泌的Reelin蛋白有助于角膜上
皮细胞的增殖，促进角膜损伤后的修复。因此，本专利技术提供了Reelin蛋白或Reln基因在角膜损伤治疗药物中的应用。
[0007]为达到上述专利技术目的，本专利技术提供的技术方案如下：
[0008]本专利技术提供了Reelin蛋白或表达Reelin蛋白的Reln基因在角膜损伤治疗药物中的应用。
[0009]在本专利技术中，所述Reln基因在角膜缘的淋巴管内皮细胞表达并分泌所述Reelin蛋白。
[0010]在本专利技术中，所述Reelin蛋白作用于角膜上皮细胞或角膜缘干细胞，促进角膜损伤后的修复。
[0011]在本专利技术中，所述Reelin蛋白通过促进角膜缘干细胞的分化，或角膜上皮细胞的增殖和/或迁移的方式修复角膜。
[0012]在本专利技术中，所述Reelin蛋白通过改善角膜缘微环境，促进角膜缘干细胞的分化，或角膜上皮细胞的增殖和/或迁移。
[0013]在本专利技术中，通过增加角膜缘淋巴管内皮细胞Reln基因的表达，促使角膜缘淋巴管分泌Reelin蛋白能力增加。
[0014]本专利技术还提供了一种用于治疗角膜损伤的药物，其特征在于该药物含有治疗有效量的Reelin蛋白。
[0015]在本专利技术中，所述有效量的Reelin蛋白至少为1μg/ml。
[0016]在本专利技术中，该药物由Reelin蛋白粉末与无菌PBS溶液或生理盐水混合后制备而成。
[0017]在本专利技术中，该药物为含Reelin蛋白的水凝胶。
[0018]根据本专利技术，利用Reelin蛋白或表达Reelin蛋白的Reln基因对角膜缘干细胞的分化、角膜上皮细胞的增殖与迁移的促进作用，通过提高Reelin蛋白的浓度或增加局部Reln基因的表达，从而可以有效促进受损角膜的快速修复，该方法属于改善角膜及角膜缘微环境，无需手术或免疫抑制。
附图说明
[0019]接下来，在附图和实施例的描述中，为了方便，将术语“人角膜上皮细胞系(Human corneal epithelial)”简称为“HCE
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T”；将术语“小鼠角膜缘上皮细胞系(Mouse limbal epithelial cells)”简称为“TKE2”；将术语“角膜上皮细胞(Corneal epithelial cells)”简称为“CECs”。
[0020]图1是CCK8实验测定Reelin蛋白对角膜上皮增殖能力影响图；
[0021]图2是EdU摄取实验测定Reelin蛋白对角膜上皮增殖能力影响图；
[0022]图3是细胞划痕实验测定Reelin蛋白对角膜上皮迁移能力影响图；
[0023]图4是Transwell共培养穿膜实验测定Reelin蛋白对角膜上皮迁移能力影响图；
[0024]图5是机械刮除模型后不同损伤时间节点角膜形态和荧光素染色图；
[0025]图6是碱烧伤后角膜中Reelin蛋白和LYVE1变化情况图；
[0026]图7是RT
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qPCR测定Reln基因的相对表达量和Elisa测定Reelin蛋白的表达量图。
具体实施方式
[0027]在下文中，将根据示例性的实施例对本专利技术进行详细的描述，但本专利技术并不限于这些实施例。本专利技术以下述的多种形式具体化，但是不应被解释为限于本文阐明的示例性实施例。因此，本专利技术的详细描述及实施例将向本领域的普通技术人员传达本专利技术的范围，并且被解释为处于本专利技术的范围内。
[0028]本专利技术首次发现Reelin蛋白可以通过改善角膜以及角膜缘微环境，促进角膜缘干细胞的分化、角膜上皮细胞的增殖与迁移，修复受损角膜，并用于治疗角膜生理或病理损伤。其中，当Reelin蛋白浓度≥1μg/ml时，其有显著的促进角膜恢复作用。优选的，Reelin蛋白浓度为2μg/ml，更优选的，Reelin蛋白浓度为5μg/ml。
[0029]所述Reelin蛋白由角膜缘的淋巴管内皮细胞分泌，作用于角膜上皮细胞或本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.Reelin蛋白或表达Reelin蛋白的Reln基因在角膜损伤治疗药物中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述Reln基因在角膜缘的淋巴管内皮细胞表达并分泌所述Reelin蛋白。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述Reelin蛋白作用于角膜上皮细胞或角膜缘干细胞，促进角膜损伤后的修复。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述Reelin蛋白通过促进角膜缘干细胞的分化，或角膜上皮细胞的增殖和/或迁移的方式修复角膜。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述Reelin蛋白通过改善角膜缘微环境，促进角膜缘...

【专利技术属性】
技术研发人员：王丽强，黄一飞，李宗源，徐宁，蒋依琳，肖国城，李钊，刘书钰，
申请(专利权)人：中国人民解放军总医院第三医学中心，
类型：发明
国别省市：