一种固定醛缩酶的方法技术

本发明专利技术公开了一种固定醛缩酶的方法，属于生物工程技术领域，以树脂为固定化载体，包括醛缩酶的构建、环氧树脂载体的修饰和固定化醛缩酶的制备，本发明专利技术具体制备方法包括：以环氧官能团的树脂为载体，使用硼酸盐和亚氨基二乙酸修饰环氧基团，接下来用H2SO4水解剩余的环氧基团，用碘酸盐氧化酸解的二醇基为醛基，然后采用金属盐来修饰环氧树脂。最后借助环氧树脂表面的金属离子与还原剂还原希夫碱共价键对醛缩酶进行双官能团固定。本发明专利技术使用的树脂进行载体结合法，固定效率更高，更利于重复利用，降低用酶生产成本。降低用酶生产成本。

【技术实现步骤摘要】
一种固定醛缩酶的方法


[0001]本专利技术属于生物工程
，具体涉及一种树脂双官能团固定醛缩酶的方法。

技术介绍

[0002]酮酸作为一种有生物活性的双官能团物质，在生物体内拥有重要作用的有机酸，在氨基酸新陈代谢和维持氧化还原状态的过程中发挥中心作用。此外，酮酸是有机合成、药物合成及生物合成的重要中间体，在医药、饲料、食品、化学合成等领域有着重要的应用。例如，在医药领域，2
‑
酮基
‑
L
‑
古洛糖酸已被广泛用于合成L
‑
抗坏血酸，复方α
‑
酮酸片用于治疗慢性肾功能衰竭。在化学合成中，酮酸被用作农药，诊断检测试剂，氨基酸和高性能弹性材料的合成前体。随着酮酸应用领域的不断增加，当前国内外市场对酮酸的需求也在随之增加。因此，发展绿色酮酸制备工业已成为国内外研究与产业界人员共同关注的热点。如申请公布号为CN111951898A的专利技术专利公开了一种筛选能将L
‑
氨基酸转化为2
‑
酮酸酶的方法，其中所述的AT酶(转氨酶)级联反应均为游离酶，无法进行回收。
[0003]目前，酮酸的工业化生产方式主要包括化学合成和生物合成。α
‑
酮酸主要由化学合成法生产，该法反应步骤多、环境污染严重、产物得率较低。目前只有少数酮酸的生物合成方法已被应用于工业化生产。虽然酮酸的生物合成方法具有成本低、反应条件温和、环境友好等特点，但一些关键的问题和挑战仍然有待解决，包括不可再生资源的利用、化学途径造成的环境污染，酶法成本过多等，这些问题严重阻碍了酮酸工业的绿色发展。
[0004]综合工业化与节约成本等方面，提高生物催化工艺的可持续性，具有十分重大的价值和意义。固定化酶技术(immobilized enzyme)是20世纪60年代发展起来的一种新技术，与游离酶相比，固定化酶在保持其高效专一及温和的酶催化反应特性的同时，又克服了游离酶的不足之处，呈现贮存稳定性高、分离回收容易、可多次重复使用、操作连续可控、工艺简便等一系列优点。固定化酶不仅在化学、生物学及生物工程、医学及生命科学等学科领域的研究异常活跃，得到迅速发展和广泛的应用，而且因为具有节省资源与能源、减少或防治污染的生态环境效应而符合可持续发展的战略要求。
[0005]固定化酶的制备方法有物理法和化学法两大类。物理方法包括吸附法，包埋法，酶整体结构保持不变，催化活性得到很好保留。但物理方法对酶结合效率低，在工业化生产中酶容易浸出，导致生产成本较高。如授权公告号为CN106434622B的专利技术专利中公开了一种共固定化酶的制备方法，所述固定化载体为海藻酸钠凝胶，所述的办法中将海藻酸钠溶液与酶液混合，滴入氯化钙水溶液中，得到固定化酶。然而上述的固定化办法为包埋法，结合效率低，而且固定化酶的机械强度低，容易破裂导致酶浸出。化学法包括结合法、交联法。将酶通过化学键连接到天然的或合成的高分子载体上，使用偶联剂通过酶表面的基团将酶交联起来，而形成相对分子量更大、不溶性的固定化酶的方法。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于提供一种树脂双官能团固定醛缩酶的方法。本专利技术使用的树脂
进行载体结合法，是化学法中一种更为有效、常见的固定化办法。相比于物理吸附法，酶蛋白的非必需基团通过共价键和载体形成不可逆的连接，固定效率更高，更利于重复利用，降低用酶生产成本。在工业生产、化学分析和医药等方面有诱人的应用前景。
[0007]本专利技术的技术方案是：一种固定醛缩酶的办法，具体包括下列步骤：
[0008]步骤1：提取酶液
[0009]将如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列(来源于Pseudomonas putida的反式
‑
o
‑
羟基亚苄基丙酮酸水合酶
‑
醛缩酶基因)构建到pET
‑
28a(+)载体上，并转入大肠杆菌中表达，最后用亲和层析纯化得到纯酶液
[0010]步骤2：环氧树脂载体的修饰方法
[0011](1)以环氧官能团的树脂为载体，使用硼酸盐和亚氨基二乙酸修饰环氧基团；
[0012]所述的硼酸盐溶液包括硼酸钠、硼酸钾
[0013](2)接下来用硫酸水解剩余的环氧基团，用碘酸盐氧化酸解的二醇基为醛基，然后采用金属盐来修饰环氧树脂得到修饰后的环氧树脂；
[0014]步骤3：修饰后的环氧树脂对醛缩酶双官能团固定方法
[0015]将环氧树脂表面的金属离子(金属盐)与还原剂还原希夫碱共价键对醛缩酶进行双官能团固定；
[0016]所述的还原剂包括硼氢化钠、氰基硼氢化钠、硼氢化钾。
[0017]优选所述的步骤2中所述的环氧树脂为ES
‑
1、ES
‑
108、ES
‑
103B中的任意一种；所述的碘酸盐包括高碘酸钠、高碘酸钾、高碘酸钡；所述的金属盐溶液包括CaCl2、MgCl2、NiSO4、CuCl2。
[0018]优选所述的步骤2中所述的硼酸盐溶液浓度为0.05M～0.5M，pH为7.4～8.5；所述的亚氨基二乙酸浓度为0.1M～1.5M；所述的硫酸溶液浓度为0.5M～3M；所述的碘酸盐溶液浓度为0.05M～0.5M；所述的金属盐溶液浓度为2～15mg/mL。
[0019]优选所述的硼酸钠溶液浓度为0.1M，pH为8.5；所述的亚氨基二乙酸浓度为1M；所述的硫酸溶液浓度为2M；
[0020]所述的碘酸盐溶液浓度为0.1M；所述的金属盐溶液浓度为10mg/mL。
[0021]优选所述的步骤S1的具体步骤如下：
[0022](1)醛缩酶的构建及制备：将核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示构建到pET
‑
28a(+)载体上，并转入到大肠杆菌BL 21(DE 3)中；
[0023](2)取步骤(1)构建的NahE至LB培养基，并加入抗生素，培养过夜，再将该菌液转接至TB培养基中，并加入抗生素，振荡培养至OD600达到0.6～0.7，加入IPTG低温诱导；
[0024](3)离心收集湿菌体沉淀，加入磷酸二氢钠
‑
磷酸氢二钠缓冲溶液以制成菌体悬浮液，然后利用超声波细胞粉碎仪破碎菌体，经冷冻离心后取上清液，即为醛缩酶全细胞裂解液；全细胞裂解液用Ni
‑
NTA亲和层析洗脱杂蛋白再超滤洗脱，得到纯酶液。
[0025]优选所述的步骤2环氧树脂载体的修饰方法如下：
[0026](1)取环氧树脂，将硼酸钠、亚氨基二乙酸、氯化盐溶液，依次搅拌树脂后洗涤；
[0027](2)加入H2SO4和碘酸盐搅拌，洗涤过滤；依次与盐溶液、金属盐溶液搅拌后得到修饰后的环氧树脂；
[0028]氯化盐包括NaCl、KCl，溶液浓度为250mM～2M，pH为7.0～8.0；盐溶液包括NaCl、
KCl、NaHCO3。
[0029]优选所述的步骤3修饰后本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种固定醛缩酶的方法，其特征在于：包括下列步骤：步骤1：提取酶液将如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列构建到pET
‑
28a(+)载体上，并转入大肠杆菌中表达，最后用亲和层析纯化得到纯酶液步骤2：环氧树脂载体的修饰方法(1)以环氧官能团的树脂为载体，使用硼酸盐和亚氨基二乙酸修饰环氧基团；所述的硼酸盐溶液包括硼酸钠、硼酸钾(2)接下来用硫酸水解剩余的环氧基团，用碘酸盐氧化酸解的二醇基为醛基，然后采用金属盐来修饰环氧树脂得到修饰后的环氧树脂；步骤3：修饰后的环氧树脂对醛缩酶双官能团固定方法将环氧树脂表面的金属离子与还原剂还原希夫碱共价键对醛缩酶进行双官能团固定；所述的还原剂包括硼氢化钠、氰基硼氢化钠、硼氢化钾。2.根据权利要求1所述的固定醛缩酶的方法，其特征在于：所述的步骤2中所述的环氧树脂为ES
‑
1、ES
‑
108、ES
‑
103B中的任意一种；所述的碘酸盐包括高碘酸钠、高碘酸钾、高碘酸钡；所述的金属盐溶液包括CaCl2、MgCl2、NiSO4、CuCl2。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的步骤2环氧树脂载体的修饰方法如下：(1)取环氧树脂，将硼酸钠、亚氨基二乙酸、氯化盐溶液，依次搅拌树脂后洗涤；(2)加入H2SO4和碘酸盐搅拌，洗涤过滤；依次与盐溶液、金属盐溶液搅拌后得到修饰后的环氧树脂；氯化盐包括NaCl、KCl，溶液浓度为250mM～2M，pH为7.0～8.0；盐溶液包括NaCl、KCl、NaHCO3。4.根据权利要求2或3所述的固定醛缩酶的方法，其特征在于：所述的步骤2中所述的硼酸盐溶液浓度为0.05M～0.5M，pH为7.4～8.5；所述的亚氨基二乙酸浓度为0.1M～1.5M；所述的硫酸溶液浓度为0.5M～3M；所述的碘酸盐溶液浓度为0.05M～0.5M；所述的金属盐溶液浓度为2～15mg/mL。5.根据权利要求4所述的固定醛缩酶的方法，其特征在于：所述的硼酸钠溶液浓度为0.1M，pH为8.5；所述的亚氨基二乙酸浓度为1Mi所述的硫酸溶液浓度为2M；所述的碘酸盐溶液浓度为0.1M；所述的金属盐溶液浓度为10mg/mL。6.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的步骤3修饰后的环氧树脂对醛缩酶双官能团固定方法如下：修饰后的环氧树脂加入醛缩酶和KH2PO4‑
K2HPO4缓冲溶液进行孵育，结束后洗涤过滤；加...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭凯，黄桂翔，胡玉静，潘婕，王雨清，王合永，赵明业，何长安，吴文静，何伟，朱宁，方正，
申请(专利权)人：南京工业大学，
类型：发明
国别省市：