单程超滤提取卵黄免疫球蛋白的方法技术

本发明专利技术提供了一种简单、快速提取卵黄免疫球蛋白的方法，属于生物分离工程技术领域，主要是应用超滤分离技术，经过稀释、冻融、离心和单程超滤四个步骤，即可从卵黄中提取卵黄免疫球蛋白，在提取过程中，未使用有机溶剂，有效避免了有机溶剂引起的蛋白变性，杜绝了溶剂残留造成的产品安全隐患。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物分离工程与
，具体是应用单程超滤技术从鸡卵黄中快速 提取卵黄免疫球蛋白的方法，产品纯度可达85%。
技术介绍
免疫球蛋白是机体受抗原(如病原体)刺激后产生的，其主要作用是与抗原起免 疫反应，生成抗原_抗体复合物，从而阻断病原体对机体的危害，使病原体失去致病作用。卵黄免疫球蛋白(IgY)是指鸡卵黄中存在的主要免疫球蛋白，是母鸡在接受免疫 后的7 10天，S卩卵黄成熟期，由母鸡血液中的免疫球蛋白IgG选择性的转移到卵黄中而 形成的。所以，IgY相当于哺乳动物的IgG。同时，与IgG相比，卵黄免疫球蛋白(IgY)具有 诸多优点(1) IgY不与血清中的类风湿因子结合，不激活哺乳动物补体系统，也不与Fc受 体结合，有利于提高免疫诊断检测的特异性和敏感性；(2) IgY的性质稳定，活性保持良好， 在75oC以下，IgY活性基本不受影响，在pH3 12之间，活性保持不变；(3)无需采血，符合 国际动物保护条例；(4)价廉易得，一枚鸡蛋中含有的IgY的量相当于从200mL血液中提取 的量；(5)由于种系发生距离相差很大，禽类IgY与哺乳动物免疫球蛋白之间不会发生交叉 血清学反应。因此，近年来，许多学者及生物制品公司都在着手于IgY的分离、纯化研究。目前，从卵黄中分离IgY的主要方法有盐析法、聚乙二醇沉淀法、氯仿抽提法、中 链脂肪酸法、表面活性剂法等。然而这些技术均存在一定的局限性，其中，盐析法和聚乙二 醇沉淀法容易引起蛋白质的失活和变性；氯仿抽提法、中链脂肪酸法、表面活性剂法的处理 周期较长，存在残留问题，不利于IgY的药用。膜分离法通常指利用天然或人工合成的薄膜，以外界能量或化学位差为推动力， 对双组份或多组分的混合物进行分离、提纯和富集的方法。膜分离技术是20世纪50年代 发展起来的一项高效分离技术，与传统的分离技术相比，具有分离效率高、能耗低、可连续 操作、易于放大、无污染等优点。超滤膜是指膜孔径在1 IOOnm之间，具有不对称结构的复合膜。由于其孔径尺寸 与生物大分子的尺寸较为接近，故可用于生物大分子如蛋白质等的分离与纯化。超滤分离 是分子级的，即可截留溶液中的大分子溶质，同时使小分子溶质透过；有时也可以通过调节 溶液中微环境，使预分离的蛋白质分子和膜表面带有不同性质的电荷，再通过蛋白质分子 之间、蛋白质与膜表面之间的静电作用，达到分离的目的。目前，在生物加工领域，超滤技术 常用于蛋白质的纯化与浓缩，在工业上已有较多应用，但由于自然体系中蛋白质种类复杂， 且存在较多的同工酶，使用超滤法直接分离得到高纯度的功能蛋白质的成功实例极少。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种快速提取卵黄免疫球蛋白的方法。本专利技术采取的技术路线是1.将鸡蛋的蛋壳、蛋清和卵黄膜除去，取蛋黄液；2.使用去离子水或离子强度小于500mM、pH4. 0-10. 0的缓冲溶液将卵黄液稀释至 6-15倍，最佳为7-10倍，充分搅拌20分钟以上，于-20°C或更低温度下冷冻8小时以上，解 冻、离心，取上清液；3.利用截留分子量为100-150kDa的超滤膜对步骤2得到的上清液进行超滤分离， 分离条件为溶液PH值4-10，离子强度0-1M，截留液即为高纯度的卵黄免疫球蛋白溶液；4.将所得到的卵黄免疫球蛋白(IgY)溶液冻干，即获卵黄免疫球蛋白(IgY)干粉。具体实施例方式下面结合实施例进一步描述本专利技术。实施例1，从黄皮鸡蛋中提取卵黄免疫球蛋白(IgY)的方法，步骤1.取四个新鲜的黄皮鸡蛋，用自来水洗净蛋壳，再用纸擦干，去除蛋壳和蛋清后， 用注射器针头轻轻将蛋黄膜刺破，收集蛋黄液，约50mL ；2.使用去离子水将上述步骤获得的50mL卵黄液稀释至350mL，充分搅拌20分钟 后，置于_20°C冷冻8小时，解冻，解冻液在4°C下、用3000rpm离心，取上清液，约300mL ；3.利用截留分子量为IOOkDa的聚砜膜对步骤2得到的上清液进行超滤分离，分离 条件为4°C、pH6.0，截留液即为卵黄免疫球蛋白(IgY)溶液(约160!1^)，纯度82.5% ；4.将得到的IgY溶液置于_60°C冷阱中冻干8小时，获得IgY干粉约541mg。实施例2，从白皮鸡蛋中提取卵黄免疫球蛋白(IgY)的方法，步骤1.取三个新鲜的白皮鸡蛋，用自来水洗净蛋壳，再用纸擦干，去除蛋壳和蛋清后， 用注射器针头轻轻将蛋黄膜刺破，收集蛋黄液，约38mL ；2.使用pH4. OUOOmM的磷酸盐缓冲溶液将上述步骤获得的卵黄液稀释至380mL， 充分搅拌30分钟后，置于_20°C冷冻12小时，解冻，将解冻液在4°C下、用6000rpm离心，取 上清液，约320mL ；3.利用截留分子量为IOOkDa的再生纤维素膜对步骤2得到的上清液进行超滤 分离，分离条件为4°C、pH8.0，取截留即为卵黄免疫球蛋白(IgY)溶液液(约170mL)，纯度 84% ；4.将得到的IgY溶液置于_60°C冷阱中冻干12小时，获得IgY干粉约415mg。实施例3，从鸡蛋中提取卵黄免疫球蛋白(IgY)的方法，步骤1.取五个新鲜的鸡蛋，用自来水洗净蛋壳，再用纸擦干，去除蛋壳和蛋清后，用注 射器针头轻轻将蛋黄膜刺破，收集蛋黄液，约60mL ；2.使用pH10. 0、400mM的磷酸盐缓冲溶液将上述步骤获得的卵黄液稀释至420mL， 充分搅拌25分钟后，置于-20°C冷冻10小时，解冻，将解冻液在4°C下用5000rpm离心，取 上清液，约360mL ；3.利用截留分子量为150kDa的聚醚砜膜对步骤2得到的上清液进行超滤分离，分 离条件为4°C、pH7. 0，取截留液即为卵黄免疫球蛋白(IgY)溶液液(约200mL)，纯度80% ；4.将得到的IgY溶液置于_60°C冷阱中冻干11小时，获得IgY干粉约642mg。权利要求一种快速提取卵黄免疫球蛋白的方法，是以截留分子量为100 150kDa的超滤膜超滤处理卵黄免疫球蛋白的粗酶液，最终获得较高纯度的黄免疫球蛋白；所述黄免疫球蛋白的粗酶液是将蛋黄液经稀释、冻融、离心后得到的上清液。2.根据权利要求1所述的提取黄免疫球蛋白的方法，其特征在于所述用截留分子量 为100-150kDa的超滤膜处理时，溶液pH值4_10，离子强度0-1M。3.根据权利要求1或2所述的提取黄免疫球蛋白的方法，其特征在于所述用截留分 子量为100-150kDa的超滤膜的组件形式为中空纤维素膜、平板膜或卷式膜。全文摘要本专利技术提供了一种简单、快速提取卵黄免疫球蛋白的方法，属于生物分离工程
，主要是应用超滤分离技术，经过稀释、冻融、离心和单程超滤四个步骤，即可从卵黄中提取卵黄免疫球蛋白，在提取过程中，未使用有机溶剂，有效避免了有机溶剂引起的蛋白变性，杜绝了溶剂残留造成的产品安全隐患。文档编号C07K1/34GK101955529SQ20101050445公开日2011年1月26日 申请日期2010年10月13日 优先权日2010年10月13日专利技术者刘建国, 吕建仁, 崔占峰 申请人:中国石油大学(华东)本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种快速提取卵黄免疫球蛋白的方法，是以截留分子量为１００－１５０ｋＤａ的超滤膜超滤处理卵黄免疫球蛋白的粗酶液，最终获得较高纯度的黄免疫球蛋白；所述黄免疫球蛋白的粗酶液是将蛋黄液经稀释、冻融、离心后得到的上清液。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：刘建国，吕建仁，崔占峰，
申请(专利权)人：中国石油大学华东，
类型：发明
国别省市：37[中国|山东]