一种耐热制造技术

本发明专利技术提供了一种耐热

【技术实现步骤摘要】
一种耐热
κ
‑
卡拉胶酶及其应用


[0001]本专利技术属于生物工程
，具体涉及一种耐热
κ
‑
卡拉胶酶及其应用
。

技术介绍

[0002]卡拉胶是一种由
α
‑
1,3
‑
D
‑
半乳糖和
β
‑
1,4
‑
D
‑
半乳糖组成的线性硫酸化多糖，具有成胶能力，可作为食品增稠剂
、
凝胶剂
、
澄清剂等
。
根据结构中是否含有3，6‑
脱水
‑
D
‑
半乳糖，以及半乳糖上硫酸基团的位置和数量，卡拉胶主要分为
κ
‑
、
ι
‑
和
λ
‑
卡拉胶三种类型，其中
κ
‑
型应用最为广泛
。
κ
‑
卡拉胶分子量大
、
粘度高
、
溶解性差，生物利用度低，其应用受到了限制
。
κ
‑
卡拉胶的降解产物为
κ
‑
卡拉胶寡糖，具有抗炎
、
抗凝血
、
抗肿瘤和抗血栓形成等作用，广泛应用在食品
、
医药等领域
。
卡拉胶寡糖的制备方法有物理法
、
化学法和酶解法
>。
其中，酶解法由于条件温和
、
反应特异性好等特点，应用最为广泛
。
κ
‑
卡拉胶酶可用于寡糖的制备，该酶的来源广泛，主要来源于海洋细菌，如假单胞菌属
(Pseudomonas sp.)、
弧菌属
(Vibrio sp.)、
希瓦氏菌属
(Shewanella sp.)
等
。
高温可以降低
κ
‑
卡拉胶的粘度，促进
κ
‑
卡拉胶酶处理
κ
‑
卡拉胶，因此提高
κ
‑
卡拉胶酶的耐热性对于
κ
‑
卡拉胶的高值资源化利用具有重要意义
。

技术实现思路

[0003]本专利技术旨在至少在一定程度上解决上述技术中的技术问题之一
。
为此，本专利技术提出了一种耐热
κ
‑
卡拉胶酶，其具有较高的热稳定性和水解卡拉胶能力
。
[0004]为此，在本专利技术的第一个方面中，提供了一种耐热
κ
‑
卡拉胶酶，其由如
SEQ ID NO
：1所示序列的野生型
κ
‑
卡拉胶酶
(WT)
经过其第
154
位氨基酸突变而成
。
[0005]根据本专利技术的实施例，所述耐热
κ
‑
卡拉胶酶是将野生型
κ
‑
卡拉胶酶的第
154
位氨基酸进行突变
。
与野生型
κ
‑
卡拉胶酶相比，突变酶在
50℃
的残余活力比野生型酶高出
50
％左右，在
55℃
的残余活力比野生型高出
10
％左右，从而使
κ
‑
卡拉胶酶在卡拉胶寡糖工业生产中具有良好的应用前景
。
[0006]可选地，所述野生型
κ
‑
卡拉胶酶的第
154
位氨基酸由
Glu
变为
Ala。
[0007]可选地，所述突变方式为定点突变
。
[0008]在本专利技术的第二方面中，提供了一种编码上述耐热
κ
‑
卡拉胶酶的基因，所述基因的核苷酸序列如
SEQ ID NO
：2所示
。
[0009]在本专利技术的第三个方面中，提供了一种构建体，其包含编码上述耐热
κ
‑
卡拉胶酶的基因
。
[0010]本专利技术的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本专利技术的实践了解到
。
附图说明
[0011]图1为野生型和突变型
κ
‑
卡拉胶酶的
SDS
‑
PAGE
分析；
15s
，
60℃15s
，
72℃2min
，
30
次循环，
72℃5min
，
4℃
保存
。
[0027]扩增产物
DpnⅠ消化：
[0028]DpnⅠ1
μ
L
[0029]扩增产物
40
～
50
μ
L
[0030]在
PCR
反应液中加入1μ
LDpnI
并混匀，
37℃
反应
1h30min。
[0031]重组反应：
[0032][0033]置于
37℃
恒温反应
30min
后，降至
4℃
或立即置于冰上冷却
。
[0034]重组产物转化表达宿主：
[0035](1)
在冰上解冻
E.coliBL21
感受态细胞
。
[0036](2)
取
10
μ
L
重组产物加入到
100
μ
L
感受态细胞中，轻弹管壁混匀，冰上静置
30min。
[0037](3)42℃
水浴热激
45s
后，立即置于冰上冷却2～
3min。
[0038](4)
加入
900
μ
LLB
液体培养基
(
不添加抗生素
)
，
37℃
摇菌
1h(
转速
200rpm)。
[0039](5)
将卡那霉素抗性的
LB
固体培养基平板在
37℃
培养箱中预热
。
[0040](6)4,000rpm
离心
5min
，弃掉
900
μ
L
上清
。
用剩余培养基将菌体重悬，在
37℃
恒温箱中倒置培养
12
～
16h。
利用菌落
PCR
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种耐热
κ
‑
卡拉胶酶，其特征在于，由如
SEQ ID NO 1
：所示序列的野生型
κ
‑
卡拉胶酶经过其第
154
位氨基酸突变而成
。2.
如权利要求1所述的耐热
κ
‑
卡拉胶酶，其特征在于，所述野生型
κ
‑
卡拉胶酶的第
154
位氨基酸由<...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱艳冰，韩玉停，黄小艺，李淑钗，倪辉，姜泽东，李志朋，郑明静，杜希萍，洪涛，
申请(专利权)人：集美大学，
类型：发明
国别省市：