一种具有三重增强的肿瘤免疫治疗药物及其制备方法技术

本发明专利技术设计一种具有三重增强的肿瘤免疫治疗药物。该药物利用琥珀酰亚胺酯修饰的链球菌溶血素蛋白，与叠氮修饰的半乳糖或神经氨酸酶发生点击化学反应，分别得到半乳糖和神经氨酸酶功能化的链球菌溶血素蛋白。再将这两种功能蛋白共同封装于透明质酸壳中，得到三重增强的免疫治疗药物。治疗方案通过将该药物尾静脉注射到荷瘤小鼠体内，在肿瘤区域的透明质酸酶诱导透明质酸壳降解后，释放出两种功能化的链球菌溶血素蛋白在肿瘤细胞膜上聚集穿孔，并在肿瘤细胞表面引入半乳糖和神经氨酸酶切割唾液酸，实现增强免疫细胞激活、弱化免疫逃逸、促进穿孔杀伤的三重增强，提高肿瘤免疫治疗的疗效。效。效。

【技术实现步骤摘要】
一种具有三重增强的肿瘤免疫治疗药物及其制备方法
一、

[0001]本专利技术属于生物医药
，涉及一种具有三重增强的肿瘤免疫治疗药物及其制备方法。
二、
技术介绍

[0002]免疫治疗是一种利用机体自身免疫系统来消除肿瘤细胞，保护正常细胞的癌症治疗方法。免疫治疗的疗效可从增强免疫细胞的激活、弱化免疫逃逸、促进免疫杀伤三个方面进行增强。免疫细胞在抗肿瘤的免疫治疗中至关重要，它的激活可以通过一些细胞表面特定聚糖，如半乳糖(Gal)，封端的糖复合物参与的信号通路进行增强。免疫抑制主要受肿瘤细胞过表达免疫抑制的受体连接配体调控，这些配体的糖基化修饰，尤其是唾液酸(Sia)修饰，在肿瘤细胞的免疫逃逸过程中起关键作用。免疫杀伤则通过免疫细胞释放细胞毒性颗粒如成孔蛋白和颗粒酶来溶解肿瘤细胞。目前，免疫治疗的增强主要通过单独的弱化免疫逃逸或增强免疫细胞激活的方法来实现，但单一增强的手段对疗效的提升是有限的。
[0003]为了进一步提升免疫治疗疗效，该专利设计了一种具有三重增强的肿瘤免疫治疗药物(TEID)，利用透明质酸(HA)封装两种功能化成孔蛋白
‑
链球菌溶血素(SLO)蛋白，在荷瘤小鼠体内实现了增强免疫细胞激活、弱化免疫逃逸、促进穿孔杀伤的三重增强机制，提高了肿瘤免疫治疗的疗效。
三、
技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是：利用二苄环辛基
‑
磺基
‑
N
‑
羟基琥珀酰亚胺酯(DBCO
‑
sulfo
‑r/>NHS ester)修饰的SLO(SLO
‑
DBCO)，与叠氮修饰的半乳糖(Gal
‑
N3)或α2
‑
3，6，8神经氨酸酶A(NEU
‑
N3)发生点击化学反应，形成两种功能化SLO蛋白；SLO
‑
Gal和SLO
‑
NEU。再将SLO
‑
Gal和SLO
‑
NEU共封装于HA壳中，得到三重增强的免疫治疗药物(TEID)(图1)。治疗时将TEID尾静脉注射到荷瘤小鼠体内(图2)，TEID在小鼠体内肿瘤区域的透明质酸酶(HAase)诱导HA壳降解后，释放出SLO
‑
Gal和SLO
‑
NEU在肿瘤细胞膜上聚集穿孔，在肿瘤细胞表面引入Gal和切割SA，实现小鼠体内肿瘤细胞的两种聚糖重构和穿孔辅助的三重增强，提高肿瘤免疫治疗的疗效。
[0005]本专利技术通过以下技术方案来实现：
[0006]如图1所示，将SLO
‑
DBCO与Gal
‑
N3或NEU
‑
N3通过点击反应偶联，形成保留穿孔活性的两种功能化SLO蛋白：SLO
‑
Gal和SLO
‑
NEU，然后将SLO
‑
Gal和SLO
‑
NEU共同封装于HA壳中得到TEID。
[0007]本专利技术的工作原理：
[0008]如图2所示，TEID尾静脉注射进荷瘤小鼠体内后，利用与肿瘤细胞表面CD44的特异性识别实现TEID向肿瘤的靶向递送。在肿瘤微环境中HAase介导的TEID降解后，释放出的SLO
‑
Gal和SLO
‑
NEU借助SLO的穿孔锚定在肿瘤细胞膜上。锚定的Gal用于增强免疫细胞的激活，NEU切割细胞表面SA用于弱化免疫细胞的抑制，SLO穿孔促进免疫细胞因子向肿瘤细胞
的递送用于增强免疫杀伤，以此实现基于两种聚糖重构与穿孔辅助的三重增强的免疫治疗。
[0009]与现有技术相比，本专利技术具有以下特点：
[0010]本专利技术中设计的基于两种聚糖重构和穿孔辅助的三重增强的免疫治疗，相比于单一增强的免疫疗法，更大程度地提高了肿瘤免疫治疗的疗效。
[0011]与已有的免疫治疗增强方法相比，本专利技术具有以下优点：
[0012]1.利用TEID的肿瘤靶向降解释放两种功能化的外源成孔蛋白，在肿瘤细胞表面同时实现两种聚糖重构。
[0013]2.将两种聚糖重构与细胞穿孔过程巧妙集成，用于进一步增强免疫治疗疗效。
四、附图说明
[0014]图1.三重增强的肿瘤免疫治疗药物(TEID)制备示意图
[0015]图2.利用TEID进行三重增强的荷瘤小鼠免疫治疗示意图
五、具体实施方式
[0016]实施例1：结合图1，制备TEID。
[0017]将SLO(0.55mM)与DBCO
‑
sulfo
‑
NHS ester(47mM)在垂直旋转仪上室温混合2小时，用30kDa的超滤管超滤(14000g，4℃)除去多余的DBCO
‑
sulfo
‑
NHS ester，制得SLO
‑
DBCO。将NEU(0.02mM)与N3‑
PEG8
‑
NHS(0.1mM)在垂直旋转仪上室温混合2小时，利用30kDa的超滤管超滤(14000g，4℃)除去多余的N3‑
PEG8
‑
NHS，制得NEU
‑
N3。将4AC
‑
Gal
‑
N3(10mM)与甲醇钠(2.5mM)在干甲醇中室温搅拌过夜，用DOWEX(R)50WX8
‑
200离子交换树脂过滤后制得Gal
‑
N3。
[0018]将上述SLO
‑
DBCO(1mM)与Gal
‑
N3(10mM)在垂直旋转仪上室温混合2小时，用30kDa的超滤管超滤(14000g，4℃)除去反应中多余的Gal
‑
N3，制得SLO
‑
Gal。
[0019]将上述SLO
‑
DBCO(1mM)与NEU
‑
N3(0.01mM)在垂直旋转仪上室温混合2小时，用100kDa的超滤管超滤(14000g，4℃)除去反应中多余的SLO
‑
DBCO，制得SLO
‑
NEU。
[0020]将0.2g HA在4℃下溶于10mL水中，向溶液中滴入0.16mL甲基丙烯酸酐。然后加入5.0M NaOH调节溶液pH为8
‑
9，在4℃下连续搅拌24h，加入丙酮沉淀，乙醇洗涤后重溶于水，冷冻干燥后得到甲基丙烯酸化的HA(m
‑
HA)。将100U mL
‑1的SLO
‑
NEU和100U mL
‑1的SLO
‑
Gal加入到200μL的搅拌m
‑
HA溶液中(0.35mg mL
‑1)，然后加入0.07mg的二甲基丙烯酸甘油酯和Irgacure 2959(0.1％，w∶v)。用20mV cm
‑2紫外光照射60s引发自由本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种具有三重增强的肿瘤免疫治疗药物，其特征在于，所述的药物是利用透明质酸封装半乳糖和神经氨酸酶功能化的链球菌溶血素蛋白制得的。2.根据权利要求1所述的具有三重增强的肿瘤免疫治疗药物，其特征在于，所述的半乳糖和神经氨酸酶功能化的链球菌溶血素蛋白是利用琥珀酰亚胺酯修饰的链球菌溶血素蛋白分别与叠氮修饰的半乳糖或神经氨酸酶发生点击化学反应制得的。3.根据权利要求1所述的具有三重增强的肿瘤免疫治...

【专利技术属性】
技术研发人员：鞠熀先，陈云龙，杨媛娇，
申请(专利权)人：南京大学，
类型：发明
国别省市：