一种冻存细胞的复苏方法技术

本发明专利技术提供了一种冻存细胞的复苏方法，在复苏细胞的完全培养基中添加一定浓度的内质网应激抑制剂，

【技术实现步骤摘要】
一种冻存细胞的复苏方法


[0001]本专利技术属于细胞生物学
，具体涉及一种冻存细胞的复苏方法
。

技术介绍

[0002]细胞复苏是指将冻存在液氮或者
‑
70℃
的休眠状态细胞解冻之后重新培养，使之恢复生长，进入细胞周期，获得细胞类型特异的生物学功能，进而分裂产生子细胞的过程
。
细胞复苏是细胞生物学的重要技术手段，对于生物学保种
、
生命科学与医学中的细胞研究有着重要意义
。
[0003]细胞复苏率是指冻存后的细胞恢复正常功能的比例，复苏率作为衡量细胞复苏能力的指标，直接反映了细胞复苏的效率和质量
。
细胞复苏率受多种因素的综合影响，包括细胞内外环境因素，如：氧气浓度
、
营养物质供应
、
细胞外基质
、
细胞间相互作用等，这些因素对细胞复苏能力产生直接影响，通过提供适宜的环境来促进细胞功能的恢复；另一方面，细胞自身调控机制如细胞凋亡
、DNA
修复
、
蛋白质合成与降解等也参与了细胞复苏过程的调控与决定
。
[0004]渗透性防冻剂如甘油
、DMSO
，以及膜稳定剂如海藻糖，氨基酸或生物抗氧化剂等可减缓渗透性损伤，避免细胞的冰晶损伤，稳定细胞结构，以改善细胞的回收率
。
但是细胞在休眠或停滞期间，可能会遭受
DNA
损伤
、
蛋白质氧化
、/>细胞膜破裂等多种损伤，从低温快速复苏到
37℃
的过程中，环境突然变化引起的刺激，如氧化应激反应，自由基释放，离子内环境紊乱等也会导致细胞损伤，使得细胞在复苏培养后的一段时间内仍然会发生凋亡，严重影响细胞复苏率及复苏质量，特别是冻存时间越长对细胞，损伤可能越重，复苏效果越差
。
[0005]细胞凋亡作为一种程序性细胞死亡方式，包括外源性的死亡受体途径
、
内源性的线粒体损伤途径和近期发现的内质网应激途径
。
细胞凋亡时，内质网发生扩张，与细胞膜融合
。
生理状态下的适度细胞凋亡有助于清除受损细胞，促进新生细胞的生成和功能恢复
。
然而，过度的细胞凋亡可能导致细胞死亡和组织功能损害，从而降低细胞复苏率
。
内质网应激是细胞内环境紊乱的结果，可以触发一系列的细胞应答，包括细胞凋亡
、
炎症反应
、
氧化应激等
。
内质网应激可能通过影响细胞内的信号传导
、
蛋白质合成与折叠等多个途径，影响细胞的平衡状态
。
内质网是真核细胞内非常重要的细胞器，其功能涉及蛋白质合成
、
加工
、
修饰
、
折叠和运输，
Ca
2+
平衡的维持，脂类和糖类代谢等一系列重要的生物学过程
。
在某些情况下，当内质网的生理功能发生紊乱时会启动一定应激机制，进而引起内质网应激，暂停早期蛋白质的合成，减少未折叠蛋白或错误折叠蛋白在内质网内的聚集，从而恢复细胞的正常生理功能，保护细胞，但如果内质网应激反应持续进行或无法缓解，信号就会由促生存转向促凋亡，最终引起细胞凋亡
。
[0006]为了解决目前冻存细胞复苏率低的问题影响，本专利技术提供了一种冻存细胞复苏的方法
。
本专利技术的目的是通过以下技术方案实现的：
[0007]一种冻存细胞复苏方法，包括步骤如下：
[0008]步骤1：从
‑
70
度或液氮中取出细胞冻存管，立即置于
37℃
水浴，融化
40
‑
80
秒，加入
5
倍以上完全培养基，转移至离心管中，
800
‑
1000rpm
，离心3分钟，吸弃上清，保留细胞沉淀；步骤2：加入含有内质网应激抑制剂的完全培养基，吹打混匀，将细胞悬液转移至培养板或培养皿，初始细胞密度为
30
‑
40
％；
[0009]步骤3：静止
37℃
培养
24
小时，更换含有内质网应激抑制剂的完全培养基；
[0010]步骤4：继续培养，每2天更换含有内质网应激抑制剂的完全培养基，培养至细胞融合度达
90
％以上，按
1:3
传代培养于常规完全培养基中
。
[0011]进一步的，上述内质网应激抑制剂为牛磺熊去氧胆酸
(Tauroursodeoxycholic acid,TUDCA)
，在完全培养基中的终浓度为
10
‑
40
μ
mol/L。
[0012]进一步的，上述内质网应激抑制剂为4‑
苯基丁酸
(4
‑
Phenylbutyric acid,4
‑
PBA)
，在完全培养基中的终浓度为1‑
2mmol/L。
[0013]技术效果：
[0014]本专利技术提供了一种冻存细胞复苏的方法，在完全培养基中添加一定浓度的内质网应激抑制剂，
TUDCA 10
‑
40
μ
mol/L
，或4‑
PBA 1
‑
2mmol/L
，当细胞所处环境突然变化引起对细胞的损伤刺激过程中，抑制细胞的内质网应激，减少复苏后细胞的凋亡率，大大提高复苏效率
。
说明书附图：
[0015]图
1Hepa1
‑6细胞的细胞损失率柱状图
(*:p<0.05
与对照组比较
)
[0016]图
2Hepa1
‑6细胞的
Heochst
染色
(
上左：对照组；上中：4‑
BPA 1mmol/L
；上右边：4‑
BPA 2mmol/L
；下左：
TUDCA 5
μ
mol/L
；下中：
TUDCA 10
μ
mol/L
；下右：
TUDCA 20
μ
mol/L)
图
3Hepa1
‑6细胞的凋亡率柱状图
(*:p<0.05
与对照组比较
)
[0017]图4大鼠骨髓间充质干细胞的细胞损失率柱状图柱状图
(*:p<0.05
与对照组比较
)
[0018]图5大鼠骨髓间充质干细胞的凋亡率柱状图
(*:p<0.05
与对照组比较
)
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种冻存细胞复苏方法，包括步骤如下：步骤1：从
‑
70
度或液氮中取出细胞冻存管，立即置于
37℃
水浴，融化
40
‑
80
秒，加入3‑5倍完全培养基，转移至离心管中，
800
‑
1000rpm
，离心3分钟，吸弃上清，保留细胞沉淀；步骤2：加入含有内质网应激抑制剂的完全培养基，吹打混匀，将细胞悬液转移至培养板或培养皿，初始细胞密度为
30
‑
40
％；步骤3：静止
37℃
培养<...

【专利技术属性】
技术研发人员：梁小华，吴明军，梁绍燕，钟海英，易勤，
申请(专利权)人：重庆医科大学附属儿童医院，
类型：发明
国别省市：