一种从束丝藻中提取鱼腥藻毒素的方法技术

本发明专利技术公开了一种从束丝藻中提取鱼腥藻毒素的方法，包括以下步骤：

【技术实现步骤摘要】
一种从束丝藻中提取鱼腥藻毒素的方法


[0001]本专利技术属于生化分离和资源可持续化利用领域，尤其涉及一种鱼腥藻毒素的提取方法。

技术介绍

[0002]富营养化水体频繁暴发蓝藻水华已成为全球面临的重大环境问题，一些蓝藻水华能够产生有害的蓝藻毒素，对淡水生态系统和人类健康构成了严重的威胁。其中鱼腥藻毒素是一类小分子生物碱类蓝藻神经毒素，主要由束丝藻属、长孢藻属、颤藻属以及常丝藻属等丝状蓝藻产生，长期接触或者直接饮用毒藻污染水源会引起动物神经中毒乃至死亡。
[0003]鱼腥藻毒素标准样品是开展鱼腥藻毒素科学研究及水体检测所需要的重要基础化学试剂。随着对鱼腥藻毒素研究的广泛深入，科研人员对鱼腥藻毒素标准品的需求量日益增长。由于鱼腥藻毒素产毒样品难以获得以及提取工艺技术限制，目前国内外关于鱼腥藻毒素纯品的提取、纯化与制备等相关研究未见报道，鱼腥藻毒素标准样品也依赖于进口，且价格非常昂贵，使得研究经费成本较高，一般中小型研究单位难以开展相关研究工作。
[0004]目前研制开发鱼腥藻毒素标准品的提取、纯化工艺成为亟需解决的问题。目前，在鱼腥藻毒素标准品的提取、纯化工艺中，野外产鱼腥藻毒素样品较难获得，且成分复杂，毒素含量低，制备结果重复性差。并且，由于鱼腥藻毒素分子结构的特殊性，常规的提取、纯化工艺适配性差，提取得到的鱼腥藻毒素存在纯度低、量少等缺陷。

技术实现思路

[0005]本专利技术所要解决的技术问题是克服以上
技术介绍
中提到的不足和缺陷，提供一种提取量多、纯度高的从束丝藻中提取鱼腥藻毒素的方法。为解决上述技术问题，本专利技术提出的技术方案为：
[0006]一种从束丝藻中提取鱼腥藻毒素的方法，包括以下步骤：
[0007](1)获取鱼腥藻毒素的产毒毒株束丝藻藻株；
[0008](2)破碎步骤(1)中得到的束丝藻藻株，加入甲醇溶液，在搅拌下萃取鱼腥藻毒素，然后离心处理，收集上清液，蒸发上清液得到粗提液；
[0009](3)利用固相萃取柱对步骤(2)中得到的粗提液进行初步纯化，得到精提液；
[0010](4)利用半制备液相色谱进一步对步骤(3)中得到的精提液进行进一步纯化，得到含鱼腥藻毒素的溶液，再蒸发、干燥即得到所述鱼腥藻毒素。
[0011]上述从束丝藻中提取鱼腥藻毒素的方法中，优选的，鱼腥藻毒素的产毒毒株为通过室内培养束丝藻藻株而得，培养时利用BG11培养基通气培养，且BG11培养基中的氮源硝酸钠利用0.1
‑
0.3g/L的丙氨酸代替。
[0012]上述从束丝藻中提取鱼腥藻毒素的方法中，优选的，控制培养温度为20
‑
25℃，光强25
‑
35μE，光暗比为14h：10h，通气量为0.1
‑
0.3L/min。
[0013]上述从束丝藻中提取鱼腥藻毒素的方法中，优选的，所述通气培养时，控制通入气
体中含有体积含量为0.1
‑
0.3％的CO2气体。
[0014]蓝藻毒素提取原料的选择一般如下途径：产毒蓝藻水华暴发时水面形成浮藻团，捕捞浓缩即可获得大量产毒蓝藻原料。但是产鱼腥藻毒素蓝藻水华暴发的频率要远低于产微囊藻毒素水华。此外野外蓝藻中杂质成分复杂，毒素含量较低且不稳定，对于批量毒素纯化来说难以获得重复性的结果。相对而言，室内培养的产毒藻株，成分单一，特定条件下产毒含量稳定，重复性好。本专利技术基于束丝藻藻株的特性，通过采用室内培养可以获得产毒量更高，产毒更稳定的产毒毒株。上述培养得到的产毒毒株，通过离心收集对数生长期后期藻细胞，进行低温真空冷冻干燥后作为毒素提取原料低温保藏备用。
[0015]本专利技术对采用的培养基及培养工艺条件进行如下关键优化：利用BG11培养基通气培养时，使用丙氨酸代替硝酸钠作为改良氮源，控制通入气体中含有体积含量为0.1
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0.3％的CO2气体。更优选的，BG11培养基中使用0.2g/L的丙氨酸代替1.5g/L的硝酸钠，控制通入气体中含有体积含量为0.2％的CO2气体。针对通过室内培养束丝藻藻株来获得提取材料，本专利技术通过优化培养条件来提高了产毒藻株毒素含量，提高了毒素生产效率。具体的，利用丙氨酸作为氮源的BG11通气培养时，还通入0.1
‑
0.3％的CO2，通过该技术方案的采用，可以提高纯培养体系中藻细胞的生物量(第15天生物量提高133％)，提高单位干重藻细胞内毒素的含量(第15天毒素含量提高151％)。对于一些可以直接利用CO2作为光合作用无机碳源的蓝藻来说，CO2浓度的升高可以显著促进其光合作用效率，促进藻株的生长，尤其是采用流动的CO2，促进效果更好。但通气培养时CO2气体的含量需要控制，含量过低生物量和毒素含量均下降，含量过高影响不显著，且增加培养成本。另外鱼腥藻毒素富含氮元素，我们研究表明，丙氨酸作为小分子能够高效被束丝藻吸收利用，丙氨酸可以显著的促进束丝藻的生长，丙氨酸与束丝藻的匹配关系好。并且，在培养基中加入丙氨酸，有利于提高鱼腥藻毒素对丙氨酸的适应性，有利于后续通过丙氨酸保护鱼腥藻毒素的结构稳定性。此外，当氮充足的条件下，碳含量升高也会引起毒素含量的升高。
[0016]上述从束丝藻中提取鱼腥藻毒素的方法中，优选的，破碎产毒毒株时利用液氮反复冻融(如反复三次)的方式进行破碎。正常生长的藻细胞产生的鱼腥藻毒素主要以胞内形式存在，少量分泌到胞外，提取鱼腥藻毒素第一步关键的工作就是破碎藻细胞，获得藻毒素的粗提液。不同的细胞破碎方式对毒素的提取效果具有不同的影响。我们研究表明，相较于玻璃珠研磨等常规破碎方式，本专利技术采用的液氮反复冻融处理，最终提取得到的鱼腥藻毒素的含量更高。
[0017]上述从束丝藻中提取鱼腥藻毒素的方法中，优选的，所述步骤(2)中加入甲醇溶液时控制甲醇溶液的质量浓度为70
‑
80％，且甲醇溶液的加入量控制为每克产毒毒株中加入50
‑
70ml甲醇溶液。更选选的，所述步骤(2)中加入甲醇溶液时控制甲醇溶液的质量浓度为70％，且甲醇溶液的加入量控制为每克产毒毒株中加入60ml甲醇溶液。不同的提取试剂对毒素的提取效率具有明显的影响，我们研究表明，当甲醇浓度从30％增加到70％时，毒素提取浓度也随之升高，但当增加到100％甲醇时，毒素提取浓度下降，此时洗脱液中的杂质含量也较多，因此甲醇提取浓度为70
‑
80％为较优选择。
[0018]上述从束丝藻中提取鱼腥藻毒素的方法中，优选的，所述步骤(2)中离心处理后得到离心沉淀中再加入质量浓度为70
‑
80％的甲醇溶液重复萃取，再离心处理收集上清液，并与前一次离心处理收集的上清液合并。对离心处理后的离心沉淀再次重复萃取，可以再次
回收利用离心沉淀中残留的鱼腥藻毒素，回收利用率更高。
[0019]上述从束丝藻中提取鱼腥藻毒素的方法中，优选的，所述步骤(2)中加入甲醇溶液时还同步加入冰醋酸，控制甲醇溶液中冰醋酸的体积含量为0.05
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种从束丝藻中提取鱼腥藻毒素的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)获取鱼腥藻毒素的产毒毒株束丝藻藻株；(2)破碎步骤(1)中得到的束丝藻藻株，加入甲醇溶液，在搅拌下萃取鱼腥藻毒素，然后离心处理，收集上清液，蒸发上清液得到粗提液；(3)利用固相萃取柱对步骤(2)中得到的粗提液进行初步纯化，得到精提液；(4)利用半制备液相色谱进一步对步骤(3)中得到的精提液进行进一步纯化，得到含鱼腥藻毒素的溶液，再蒸发、干燥即得到所述鱼腥藻毒素。2.根据权利要求1所述的从束丝藻中提取鱼腥藻毒素的方法，其特征在于，鱼腥藻毒素的产毒毒株为通过室内培养束丝藻藻株而得，培养时利用BG11培养基通气培养，且BG11培养基中的氮源硝酸钠利用0.1
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0.3g/L的丙氨酸代替。3.根据权利要求2所述的从束丝藻中提取鱼腥藻毒素的方法，其特征在于，控制培养温度为20
‑
25℃，光强25
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35μE，光暗比为14h：10h，通气量为0.1
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0.3L/min。4.根据权利要求2所述的从束丝藻中提取鱼腥藻毒素的方法，其特征在于，所述通气培养时，控制通入气体中含有体积含量为0.1
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0.3％的CO2气体。5.根据权利要求1
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4中任一项所述的从束丝藻中提取鱼腥藻毒素的方法，其特征在于，破碎产毒毒株时利用液氮反复冻融的方式进行破碎。6.根据权利要求1
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4中任一项所述的从束丝藻中提取鱼腥藻毒素的方法，其特征在于，所述步骤(2)中加入甲醇溶液时控制甲醇溶液的质量浓度为70
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80％，且甲醇溶液的加入量控制为每克产毒毒株中加入50
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【专利技术属性】
技术研发人员：王素钦，罗丛强，罗玉双，
申请(专利权)人：湖南文理学院，
类型：发明
国别省市：