一种诱导猪多能性细胞的诱导剂以其构建方法与应用技术

本发明专利技术公开一种诱导猪多能性细胞的诱导剂以其构建方法与应用，属于基因工程技术领域

【技术实现步骤摘要】
一种诱导猪多能性细胞的诱导剂以其构建方法与应用


[0001]本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种诱导猪多能性细胞的诱导剂以其构建方法与应用
。

技术介绍

[0002]胚胎干细胞
(Embryonic Stem Cells
，
ESC)
作为一种发育生物学模型，可用于研究胚胎发育过程中的关键调控因子和分子机制，还可以诱导分化出具有特定功能的细胞和组织，在医药产品和再生医学的研发中可发挥重要作用
。
但与小鼠和人的
ESC
建立不同，大型哺乳动物的
ESC
很难获得和维持
。
[0003]猪是重要的家畜，鉴于它们在器官解剖
、
生理和代谢方面与人类相似，可以作为理想的医学模型
。
猪多能干细胞的产生在开发疾病模型
、
实现异种移植和改善其生产特性方面发挥着重要作用
。
然而，猪
ESC
的获得面临许多挑战，到目前为止还没有建立真正的猪
ESC。
已发表的细胞系通常不符合严格的多能性标准，被称为“ES
样”细胞
。
没有明确的培养体系，且有效性较低
。
目前，猪
ESC
的鉴定标准仍然参考于小鼠或人类胚胎干细胞的标准
。
所获得的细胞在体外培养条件下难以实现长期稳定生长，许多临床应用和猪的复杂转基因修饰无法推进
。
诱导多能干细胞<br/>(induced pluripotent stem cells
，
iPSC)
的出现为猪的干细胞工作带来了新的希望
。
[0004]通过使用多能性基因重新编程体细胞
(
如成纤维细胞
)
产生的
iPSC
，表现出类似于
ESC
的多能性表型，而且相对
ESC
来说更容易获得，被认为是药理学
、
生物医学
、
毒理学和细胞治疗的有力工具
。
将
iPSC
与克隆技术相结合，可能有助于解析复杂的基因机制
。
但在
iPSC
诱导过程中，存在着外源基因对基因组的整合问题，这不利于
iPSC
在疾病相关领域的研究和临床应用
。
[0005]在最初的研究中，使用逆转录病毒以及慢病毒载体进行诱导，诱导型慢病毒的使用可以控制重编程因子在诱导过程中的表达时间
。
后来在选择病毒时使用非整合病毒诱导
iPSC
的产生，腺病毒是一种常被使用的非整合型载体，然而使用腺病毒诱导
iPSC
具有诱导效率非常低的问题
。
为了获得无病毒的方式实现重编程，
Yamanaka
通过质粒载体实现重编程因子的瞬时表达，同时通过维持长时间的转基因表达来提高转染效率，获得小鼠
iPSC。
但实验显示，
iPSC
克隆中有一些基因没有整合到基因组中
。Cre
‑
loxP
和
PB
转座子可去除基因整合位点的外源性重编程因子，但载体和
loxP
位点仍保留在基因组中，存在中断启动子和编码序列等隐患，
iPSC
也可以通过使用修饰
mRNA
来实现重编程因子的长时间高表达，从人和小鼠成纤维细胞中有效获得，但
RNA
是不稳定的
。
添加一些化学小分子和外源成分改变培养条件也可能提高
iPSC
重编程的效率，或在
iPSC
诱导中取代一种或多种重编程转录因子
。
邓宏魁实验组利用7个小分子从小鼠体细胞中得到化学诱导的
iPSC
，还有许多其他化学小分子能够提高
iPSC
的诱导效率，在
iPSC
的产生过程中发挥作用，小分子刺激的方式简单且高度可控
。
然而，鉴于稳定的表观修饰和可塑性较低的情况，人类和猪等大型哺乳动物的体细胞对化学刺激不敏感，因此很难通过化学重编程诱导
iPSC。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的是为了提供一种利用表达内源性重编程因子获得多能性细胞的方法
。
[0007]本专利技术提供一种诱导猪多能性细胞的诱导剂，所述诱导剂为以
Cas12a
‑
Activ
载体作为基础载体骨架，将
OCT4、SOX2、CMYC、KLF4、CTNNB1、DNMT3L、TCL1、SALL4、NANOG、FBXO15、ERAS、DPPA2、DPPA3、GRB2、DPPA4、DPPA5、FTHL17、REX1、ECAT1、ECAT8、SOX15、STAT3、UTF1
和
GDF3
基因的
sgRNA
串联合成一个片段
S24
，然后连接到基础载体骨架中获得
Cas12a
‑
Activ
‑
24
重组载体或以
Cas12a
‑
Activ
载体作为基础载体骨架，将
OCT4、SOX2、KLF4、CMYC、NANOG、CTNNB1、ERAS、FBOX15、TCL1
和
DPPA2
基因的
sgRNA
串联合成一个片段是
S10
，然后连接到基础载体骨架中获得
Cas12a
‑
Activ
‑
10
重组载体
。
[0008]进一步地限定，
OCT4
基因的
Gene ID
为
100127461
；
SOX2
基因的
Gene ID
为
407739
；
CMYC
基因的
Gene ID
为
448810
；
KLF4
基因的
Gene ID
为
595111、CTNNB1
基因的
Gene ID
为
397657、DNMT3L
基因的
Gene ID
为
100621554、TCL1
基因的
Gene ID
为
100156364、SALL4
基因的
Gene ID
为
100136902、NANOG
基因的
Gene ID
为
106507523、FBXO15
基因的
Gene ID
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种诱导猪多能性细胞的诱导剂，其特征在于，所述诱导剂为以
Cas12a
‑
Activ
载体作为基础载体骨架，将
OCT4、SOX2、CMYC、KLF4、CTNNB1、DNMT3L、TCL1、SALL4、NANOG、FBXO15、ERAS、DPPA2、DPPA3、GRB2、DPPA4、DPPA5、FTHL17、REX1、ECAT1、ECAT8、SOX15、STAT3、UTF1
和
GDF3
基因的
sgRNA
串联合成一个片段
S24
，然后连接到基础载体骨架中获得
Cas12a
‑
Activ
‑
24
重组载体或以
Cas12a
‑
Activ
载体作为基础载体骨架，将
OCT4、SOX2、KLF4、CMYC、NANOG、CTNNB1、ERAS、FBOX15、TCL1
和
DPPA2
基因的
sgRNA
串联合成一个片段是
S10
，然后连接到基础载体骨架中获得
Cas12a
‑
Activ
‑
10
重组载体
。2.
根据权利要求1所述的诱导剂，其特征在于，
OCT4
基因的
Gene ID
为
100127461
；
SOX2
基因的
Gene ID
为
407739
；
CMYC
基因的
Gene ID
为
448810
；
KLF4
基因的
Gene ID
为
595111、CTNNB1
基因的
Gene ID
为
397657、DNMT3L
基因的
Gene ID
为
100621554、TCL1
基因的
Gene ID
为
100156364、SALL4
基因的
Gene ID
为
100136902、NANOG
基因的
Gene ID
为
106507523、FBXO15
基因的
Gene ID
为
100516237、ERAS
基因的
Gene ID
为
100621986、DPPA2
基因的
Gene ID
为
100620381、DPPA3
基因的
Gene ID
为
100511328、GRB2
基因的
Gene ID
为
100192436、DPPA4
基因的
Gene ID
为
100620290、DPPA5
基因的
Gene ID
为
100301558、FTHL17
基因的
Gene ID
为
100154515、REX1
基因的
Gene ID
为
100627512、ECAT1
基因的
Gene ID
为
100738024、ECAT8
基因的
Gene ID
为
102162257、SOX15
基因的
Gene ID
为
100522397、STAT3
基因的
Gene ID
为
733648、UTF1
基因的
Gene ID
为
100158138
和
GDF3
基因的
Gene ID
为
100510963。3.
根据权利要求1或2所述的诱导剂在诱导猪成纤维细胞重编程为猪多能性细胞中的应用
。4.
根据权利要求1或2所述的诱导剂在激活基因的有效性中的应用
。5.
构建权利要求1所述的诱导剂的方法，其特征在于，所述的方法如下：
(1)
构建
Cas12a
‑
Activ
‑
24
重组载体的方法：
24
个基因的
sgRNA
串联片段
S24
合成后，使用
S24+HA
‑
F
和
S24+HA
‑
R
引物对
S24
基因片段进行
PCR
扩增，此
PCR
反应会对
S24
基因片段两端加上同源臂，扩增后获得
HA
‑
S24
‑
HA DNA
片段；
(2)
使用
BsmBI
限制性内切酶对
Cas12a
‑
Activ
载体骨架进行酶切，经电泳分离胶回收，制备得到
Cas12a
‑
Activ
骨架
DNA
与
HA
‑
S24
‑
HA DNA
片段后，通过同源重组的方式将
24
个基因的
sgRNA
串联片段
S24
连入
Cas12a
‑
Activ
载体获得
Cas12a
‑
Activ
‑
24
重组载体；或
1)
构建
Cas12a
‑
Activ
‑
10
重组载体的方法：
10
个基因的
sgRNA
串联片段
S10
合成后，使用
S10+HA
‑
F
和
S10+HA
‑
R
引物对
S10
基因片段进行
PCR
扩增，此
PCR
反应会对
S10
基因片段两端加上同源臂，扩增后获得
HA
‑
S10
‑
HA DNA
片段；
2)
使用
BsmBI
限制性内切酶对
Cas12a
‑
Activ
载体骨架进行酶切，经电泳分离胶回收，制备得到
Cas12a
‑
Activ
骨架
DNA
...

【专利技术属性】
技术研发人员：牟彦双，刘忠华，耿立爽，郭晓晨，李鑫禹，
申请(专利权)人：东北农业大学，
类型：发明
国别省市：