壳聚糖修饰的海藻酸盐水凝胶三维多孔支架及其制备方法技术

本发明专利技术涉及一种壳聚糖修饰的具有特异体外降解性的海藻酸盐水凝胶三维多孔支架及其制备方法。它是以海藻酸钠为原料，将海藻酸钠溶解于磷酸盐缓冲溶液中，海藻酸钠中的羧基在水溶性碳二亚胺的活化作用下与交联剂胱胺或胱胺酸二甲酯中的氨基发生酰胺化反应，从而形成化学交联水凝胶。通过冷冻干燥可得到水凝胶的多孔支架材料，再用壳聚糖对多孔支架进行表面修饰。在适宜浓度的半胱胺酸等还原剂溶液中，水凝胶交联桥中的二硫键通过二硫键－巯基转化反应发生降解，从而使多孔支架解体而溶解消失。因此可将此类多孔支架作为体外细胞培养模板材料使用。本发明专利技术研究的水凝胶多孔支架制备简单、原料来源丰富、价廉易得，支架材料的各项理化性能、力学强度、降解速率以及表面特性在很大范围内可控。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及组织构建用三维多孔模板材料的制造，特别是一种壳聚糖修饰的海藻酸盐水凝胶三维多孔支架及其制备方法，具体为特异体外降解性的海藻酸盐水凝胶三维多 孔支架及其制备方法。
技术介绍
组织工程利用生命科学与工程科学的原理和方法，研究和开发具有修复或改善人 体组织或器官功能的新一代临床应用的取代物，用于替代组织或器官的一部分或全部功 能。组织工程的发展对生物材料提出了新的挑战，以往生物材料的研究与开发多从材料的 化学、物理以及加工性能构思，并没有从所植入生物材料的细胞水平和分子水平进行设计， 相关细胞在许多生物材料上能够很好地生长，但组织在体内的重建还涉及神经引导、血管 再生等问题，细胞还受到宿主损伤部位及其周围健康组织产生的信号分子的调控。因此，理 想的组织工程用生物材料应和目标细胞表达的特异粘连因子以及生长因子受体产生特异 作用，使目标细胞迁移至损伤部位，剌激其生长与分化，且随着组织的修复能被细胞释放的 相关酶成分完全降解。这有待于从分子水平设计和制备出剌激特异细胞反应的、具有生物 活性的可吸收材料。另一方面，在体外构建三维组织结构物的经典方法是将细胞种植于多 孔支架中进行一定时间的体外培养。所形成的工程化组织通常由支架材料、细胞以及细胞 合成的细胞外基质组成，即支架材料在细胞培养阶段通常并不降解，将所构建的三维组织 植入人体后，人工制备的支架材料具有产生免疫炎症反应的潜在危险性。 日本的0kano研究组开创性地用接枝有温度响应性聚合物如聚异丙基丙烯酰 胺(PIPAAm)的表面成分培养细胞，并通过降低温度得到了完整的由细胞和细胞外基质组 成的细胞片层，此二维细胞片层可直接用于组织重建，亦可通过多层叠加形成三维组织 结构物，这种技术称为细胞片层工程。通过分子设计和研究新的表面处理方法，接枝有 温敏性PIPAAm类聚合物的细胞培养表面的性能有了很大的提高。目前，细胞片层技术已应用于多种组织的修复 与重建，包括角膜前上皮、食管上皮、泌尿道上皮、牙周韧带、心肌和肝脏等。在蛋白质类水凝胶或纤维 素类水凝胶表面黏附和扩增后形成的细胞片层亦可通过蛋白酶或纤维素酶的酶解过程从 培养板表面剥离下来。在 磁场作用下，磁性阳离子脂质体吸附于细胞培养板表面可形成特异磁场响应性修饰层，种 植于此培养表面的成纤维细胞经黏附、铺展和增殖后很快形成细胞片层，而撤离磁场后该二维细胞片层很容易剥离下来；用磁性阳离子脂质体标记成纤维细胞和肝细胞后，在磁场 力作用下可直接在亲水性表面形成两种细胞混合的细胞片层，此类技术称为磁场力细胞片 层技术。 如前所述，细胞片层技术获得了长足的进步，在多种组织的修复与重建中表现出 潜在的应用前景。但通过细胞片层技术只能构建二维或厚度为微米级的三维工程化组织， 同时构建过程中并不能为相关细胞提供所需的三维生长微环境。毫米级的单纯由细胞和细胞外基质组成的大块三维组 织的构建还需要进一步探索其他方法与技术，这将面临很多困难与挑战，如模板材料降解 后所构建工程化组织的强度和形状保持能力、细胞的存活与功能保持、代谢等。Matsusaki 研究组将二硫键引入到化学交联聚Y-谷氨酸水凝胶中，将其作为模板材料在体外构建了 单纯由细胞和细胞外基质组成的三维工程化组织。但对于由微生物发酵产生的聚Y-谷氨酸的研究大 部分还处在实验室阶段，作为生物材料使用时其纯度还有待进一步提高。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种壳聚糖修饰的海藻酸盐水凝胶三维多孔支架及其制 备方法。采用更加容易获得，并且具有良好生物相容性的海藻酸钠作为原材料，以胱胺或胱 胺酸二甲酯作为交联剂，在水溶性碳二亚胺的活化作用下使海藻酸钠发生化学交联反应， 从而得到稳定的海藻酸盐共价交联水凝胶。水凝胶经冷冻干燥后可得到多孔结构的三维 支架。通过表面改性和修饰过程将活性物质引入到材料表面，提高了此类海藻酸盐水凝胶 的力学强度和细胞亲和性。将细胞种植于多孔支架中，在体外培养一定时间后可形成三维 的细胞/支架结构物。细胞培养后期向培养液加入适宜浓度的半胱胺酸J-乙酰基半胱氨 酸、谷胱甘肽等还原剂成分时，海藻酸盐水凝胶交联桥上的二硫键断开，即发生二硫键-巯 基转化反应，从而使水凝胶解体，而解体后的水凝胶降解产物可溶解于细胞培养液中，得到 完全由细胞和细胞外基质组成的二维细胞片层或三维组织结构物。海藻酸盐水凝胶多孔支 架作为模板材料应用于组织工程时，可以将多孔支架的厚度、尺寸、形状完全转移到所获得 的三维工程化组织中，从而可在体外构建毫米级的大块三维组织。由于交联剂结构中的二 硫键可以在谷胱甘肽等还原剂的作用下以较快速率分解为巯基，因此此类化学交联海藻酸 盐水凝胶三维多孔支架具备特异的体外降解性能。 本专利技术制备方法简单、原料来源丰富、价廉易得、水凝胶的各项理化性能、力学强 度、降解速率以及表面特性在很大范围内可控。通过表面改性和修饰过程将生物活性物质 引入到材料表面，可以显著提高三维多孔支架的力学强度和形状保持能力，有效改善支架 材料的细胞亲和性，但对其降解性能影响有限。 本专利技术提供的一种壳聚糖修饰的水凝胶三维多孔支架是以海藻酸钠为原料，将海 藻酸钠溶解于磷酸盐缓冲溶液中，海藻酸钠中的羧基可以在水溶性碳二亚胺的活化作用下 与交联剂胱胺或胱胺酸二甲酯中的氨基发生酰胺化反应形成化学交联水凝胶，预冻后冷冻干燥，用壳聚糖对得到的多孔支架进行表面修饰。 海藻酸钠单元水溶性碳二亚胺=i : 2(摩尔比)，海藻酸钠单元交联剂=2 2.5 : 0.63 2.5(摩尔比)，壳聚糖对海藻酸盐水凝胶多孔支架孔壁的修饰量约为 1 25ii g/cm2，壳聚糖的分子量选择1 100k。 本专利技术提供的壳聚糖修饰的海藻酸盐水凝胶三维多孔支架的制备方法经过下述 的步骤 1)室温和搅拌下，向海藻酸钠的磷酸盐缓冲溶液(pH = 5)中加入水溶性碳二亚 胺(EDC)，搅拌30min后再加入胱胺或胱氨酸二甲酯完全溶解，倒入塑料培养板中，室温下 放置0. 1 10h形成水凝胶。海藻酸钠的浓度35 45mg/mL。海藻酸钠单元EDC=1 : 2，海藻酸钠单元交联剂=2 2. 5 : O. 63 2. 5，均是摩尔比。 2)将上述水凝胶放入冰箱中预冷冻24小时，冷冻干燥2d，可得到多孔支架材料。 3)在壳聚糖溶液中浸泡1 10h，使壳聚糖成分吸附到多孔支架孔隙表面从而对 其进行修饰。经表面修饰的多孔支架在磷酸盐缓冲溶液(pH = 7. 4)中浸泡24小时。 4)将表面处理后的多孔支架放入冰箱中再次预冻后冷冻干燥(方法同步骤2)，可 得到力学强度和细胞亲和性均良好的多孔支架材料。 步骤2)与步骤4)中预冷冻温度为-20 _80°C ，冷冻干燥温度为0 20°C 。 步骤3)中的壳聚糖溶液浓度选择1 10mg/mL。 本专利技术中，由于海藻酸钠分子量较大，当浓度过高时不易溶解，并且所制备三维多 孔支架的降解时间过长，不适于作为体外细胞培养模板材料使用。为了縮短降解时间，本发 明采用了浓度为35 45mg/mL的海藻酸钠溶液制备水凝胶及其三维多孔支架，但在保持一 定降解速率的前提下支架材料的力学强度不足，特别是在水合作用下力学强度下降较快， 甚至影响到多孔材料的形状保持能力。另一方面，海藻酸盐水凝胶应用于本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种壳聚糖修饰的水凝胶三维多孔支架，其特征在于它是以海藻酸钠为原料，将海藻酸钠溶解于磷酸盐缓冲溶液中，海藻酸钠中的羧基可以在水溶性碳二亚胺的活化作用下与交联剂胱胺或胱胺酸二甲酯中的氨基发生酰胺化反应形成化学交联水凝胶，预冻后冷冻干燥得到多孔支架，再用壳聚糖对得到的多孔支架进行表面修饰。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：尹玉姬，赵燕燕，高思齐，
申请(专利权)人：天津大学，
类型：发明
国别省市：12[中国|天津]