一种运用谷子离体茎尖进行遗传转化的方法技术

专利名称为一种运用谷子离体茎尖进行遗传转化的方法，本发明专利技术属于植物遗传转化领域，主要为谷子遗传转化的一种新方法。谷子(Seteria italica)是我国重要的粮食作物，为建立新的谷子再生体系和获得SiSERK1(体细胞胚发生相关类受体蛋白激酶1)转基因植株。本研究以豫谷1号离体茎尖为外植体，通过组织培养获得成熟植株，并通过GUS染色证明离体茎尖可以作为遗传转化受体。其次对植物激素6

【技术实现步骤摘要】
一种运用谷子离体茎尖进行遗传转化的方法


[0001]本专利技术涉及植物基因工程
，主要是建立植物遗传转化体系，本专利技术运用谷子的离体茎尖进行组织培养，然后利用农杆菌浸染获得转基因谷子。

技术介绍

[0002]谷子是我国重要的杂粮作物，具有抗旱耐瘠、生长期短、适应性强、营养价值丰富等特点，近年来，谷子因其较小的基因组(约为490Mb)和二倍体自花授粉的特性以及谷子基因组测序完成，逐渐发展为C4类植物的模式植物，因此谷子具有非常高的实用性和研究价值.
[0003]迄今为止，关于谷子组织培养方面已取得很大进展，最早开始于20世纪70年代，日本学者BAN等在含有2，4
‑
D和KT的Blaydes培养基中培养谷子花药，并成功获得再生植株.随后，董晋江、王节之、王寒玉、袁进成等分别用谷子胚性愈伤组织、幼穗、茎尖诱导的愈伤组织和成熟胚等为外植体，通过添加不同激素，也成功获得成熟植株。然而，相对于谷子植株再生研究，转基因谷子的研究报道较少，21 世纪初，董云洲等人首次进行转基因谷子研究，他们利用基因枪轰击谷子幼穗，成功获得转基因植株，从此转基因谷子的相关研究被开启。此后，柳琳、Antony Ceasar、王寒玉、李颜方等分别用谷子幼穗及茎尖诱导的愈伤组织、成熟胚等材料为外植体，进行谷子遗传转化，并成功获得转基因谷子.从上述研究报道中得知，谷子的幼穗、幼胚、成熟胚和花药是研究谷子再生植株的主要材料.但是它们存在很大的问题，首先取材不易，容易受到季节等因素的影响；其次它们的再生效率低，并且没有突破愈伤组织这一个束缚，从一定程度上降低了谷子的再生效率，在进行谷子遗传转化时，会加大实验难度和加长实验周期。

技术实现思路

[0004](1)选取饱满种子用灭菌水浸泡2min，再用0.1％的升汞浸泡20min(每5min晃动一次)，随后用灭菌水浸泡2min，之后用80％酒精浸泡2min，最后用灭菌水清洗6次，每次1min.将暗培养4天的谷子茎尖剪下，然后放入茎尖分化培养基，进行分化培养2周，随后放入生根培养基继续培养2周，待幼苗生根后，炼苗1天，然后移入土壤进行移栽.MS培养基：4.33g
·
L
‑1MS粉+30g
·
L
‑1蔗糖+10g
·
L
‑1琼脂。
[0005](2)将培养4天的茎尖剪下，放入含有GUS基因的载体农杆菌浸染液中进行浸染，浸染时间为30 min，浸染结束后，然后放入共培养基培养3天，然后运用GUS染色分析.浸染液：4.33g
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L
‑1MS粉+30 g
·
L
‑1蔗糖+100μm
·
L
‑1AS+0.5mg
·
L
‑16
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BA+OD600＝1.0菌液；共培养基：4.33g
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L
‑1MS粉+30g
·
L
‑1蔗糖+100 μm
·
L
‑1AS+0.5mg
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L
‑16
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BA+10g
·
L
‑1琼脂.
[0006](3)随后，对诱导茎尖分化的6
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BA浓度以及用于筛选转基因苗的卡那霉素浓度进行筛选，获得最优的6
‑
BA和卡那霉素浓度。
[0007](4)进行转基因苗的筛选，同样将茎尖放到含有SiSERK1基因的农杆菌中进行浸染，浸染结束后，放入共培养基中培养3天，然后放入筛选分选培养基中，进行分化筛选，将
筛选出的阳性苗转入生根培养基中，进行生根培养，随后炼苗，转入土壤中进行培养.筛选分化培养基：4.33g
·
L
‑1MS粉+30g
·
L
‑1蔗糖 +250mg
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L
‑1头孢+0.5mg
·
L
‑16
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BA+10g
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L
‑1琼脂+25mg
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L
‑1卡那霉素。
[0008](5)在土壤中生长4周后，剪去谷子叶片，提取谷子基因组DNA，运用SiSERK1基因的上下游引物进行PCR鉴定，鉴定结束后，提取阳性植株的RNA反转录cDNA，进行qRT
‑
PCR检测转基因植株体内 SiSERK1基因的表达情况。
附图说明
[0009]图1：组培苗培养过程；(a)谷子种子分布于MS培养基；(b)暗培养4天的茎尖；(c)茎尖分布于MS培养基；(d)MS培养基中分化2周的分化苗；(e)1/2MS培养基中生根1周的分化苗；(f)1/2MS培养基中生根 2周的分化苗。
[0010]图2：GUS染色结果；CK：未被农杆菌浸染的茎尖外植体GUS染色结果.样1和样2：被农杆菌浸染过的茎尖外植体GUS染色结果.
[0011]图3：6
‑
BA和卡那霉素的浓度筛选；(A).茎尖分化率统计；(B)卡那霉素的浓度筛选.将4日龄的茎尖剪断，放入含卡那霉素浓度梯度的筛选分化培养基中。2周后，统计不同浓度卡那霉素处理的苗梢成活率； (C).卡那霉素对植物的影响.(1)：含6
‑
BA(0.5mg
·
L
‑1)的分化苗培养2周。(2)
‑
(4)：将含卡那霉素(25mg
·
L
‑1) 和6
‑
BA(0.5mg
·
L
‑1)的分化苗培养2周.
[0012]图4：转基因苗筛选；(a)筛选分化茎尖1周；(b)筛选分化茎尖2周；(c)筛选分化茎尖4周；(d)分化茎尖生根2周；(e)4周后分化的茎尖表型；(f)转基因植株在土壤中培养1周；(g)转基因植株在土壤中培养 4周；(h)分化的茎尖生根2周。
[0013]图5：SiSERK1转基因植株的鉴定与表达分析；(A)SiSERK1菌株的鉴定。M：Trans2K DNA标记，1
‑
20：确定的菌落；(B)转基因植物的鉴定。M：Trans2K DNA标记，1：野生型植物，2
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13：转基因株系；(C) SiSERK1基因表达分析。Yugu1：野生型植物：SiSERK1
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OE
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L1
‑
LA：转基因株系.图中小写字母表示转基因植物(SiSERK1
‑
OE
‑
l1
‑
l4)和野生型植物(Yugu1)中SiSERK1基因表达水平的显著性分析(P＜0.05)
具体实施方式
[0014](1)组培苗的获得
[0015]首先选取饱满种子用灭菌水浸泡2min，再用0.1％的升汞浸泡20min(每5min晃动一次)，随后用灭菌水浸泡2min，之后用80％酒精浸泡2min，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
本发明的主要特征为运用谷子离体茎尖为遗传转化的直接受体材料，运用GUS染色证明材料的可行性，获得转基因材料，并用qRT
‑
PCR进一步去验证，确保...

【专利技术属性】
技术研发人员：武国凡，田农夫，折发文，曹澳华，李文博，
申请(专利权)人：田农夫折发文曹澳华李文博，
类型：发明
国别省市：