CaKnot1-U5蛋白及其应用制造技术

本发明专利技术公开了CaKnot1

【技术实现步骤摘要】
CaKnot1
‑
U5蛋白及其应用


[0001]本专利技术涉及生物
，具体地说，涉及CaKnot1
‑
U5蛋白及其应用。

技术介绍

[0002]辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici)能够侵染辣椒、番茄等多种茄科和葫芦科作物引发毁灭性病害，难防难治，严重影响蔬菜品质与产量，常引发巨大的经济损失。目前对其防治主要依赖化学农药，但化学药剂的大量使用导致病原菌抗药性提高，农药残留和环境污染加剧。新型绿色植保方法的研发刻不容缓。
[0003]辣椒疫霉菌在侵染寄主时会分泌大量效应因子，可通过与寄主体内多种靶标互作干扰寄主免疫反应或改变其代谢途径，从而促进其侵染与定殖。但效应因子若被寄主受体蛋白识别则会激活寄主免疫反应，限制病原菌的扩散。因此，效应因子是病原菌与寄主互作过程中的桥梁和媒介，既能决定病原菌毒力强弱，又能调控植物抗性激发与否，其功能及作用机制研究具有重要意义，可为基于病原菌与寄主互作关系设计持久高效病害防控策略提供理论依据。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是提供CaKnot1
‑
U5蛋白及其应用。
[0005]为了实现本专利技术目的，第一方面，本专利技术提供CaKnot1
‑
U5蛋白(源自辣椒)，其为：
[0006](A)由SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
[0007](B)SEQ ID NO:4所示序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等功能的由(A)衍生的蛋白质。
[0008]第二方面，本专利技术提供一种融合蛋白，其为包含促溶标签的CaKnot1
‑
U5蛋白；
[0009]其中，所述促溶标签可选自MBP(麦芽糖结合蛋白)、SUMO(小分子泛素样修饰蛋白)、GST(谷胱甘肽转移酶)、TRX(硫氧还原蛋白)等。
[0010]优选地，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示(含TRX标签)。
[0011]第三方面，本专利技术提供编码所述CaKnot1
‑
U5蛋白或所述融合蛋白的核酸分子。
[0012]第四方面，本专利技术提供含有所述核酸分子的生物材料，所述生物材料包括但不限于重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、病毒载体、工程菌或转基因细胞系。
[0013]第五方面，本专利技术提供所述CaKnot1
‑
U5蛋白或融合蛋白以及表达所述CaKnot1
‑
U5蛋白或融合蛋白的原核或真核表达系统在抑制辣椒疫霉菌以及由辣椒疫霉菌所致的植物病害中的应用。
[0014]进一步地，所述应用包括：
[0015](1)将所述CaKnot1
‑
U5蛋白或融合蛋白配制成蛋白溶液，或者将表达所述蛋白或融合蛋白的大肠杆菌菌液或其稀释液施于植物根际周围的土壤或育苗基质中；或，
[0016](2)将所述CaKnot1
‑
U5蛋白或融合蛋白配制成蛋白溶液，或者将表达所述蛋白或融合蛋白的大肠杆菌菌液或其稀释液对植株进行灌根处理；或
[0017](3)将所述CaKnot1
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U5蛋白或融合蛋白配制成蛋白溶液，或者将表达所述蛋白或融合蛋白的大肠杆菌菌液或其稀释液进行浸种处理；或
[0018](4)用所述CaKnot1
‑
U5蛋白或融合蛋白配制成蛋白溶液，或者将表达所述蛋白或融合蛋白的大肠杆菌菌液或其稀释液喷洒植株。
[0019]第六方面，本专利技术提供一种组合物，所述组合物包含所述CaKnot1
‑
U5蛋白或融合蛋白，以及辣椒疫霉效应因子NLP779或其截短体；或者，
[0020]所述组合物包含表达所述CaKnot1
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U5蛋白或融合蛋白的原核或真核表达系统，以及表达辣椒疫霉效应因子NLP779或其截短体的原核或真核表达系统。
[0021]其中，所述辣椒疫霉效应因子NLP779为：
[0022](a)由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
[0023](b)SEQ ID NO:1所示序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等功能的由(a)衍生的蛋白质。
[0024]辣椒疫霉效应因子NLP779截短体由SEQ ID NO:1所示序列第54
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277位氨基酸组成。
[0025]NLP779编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
[0026]第七方面，本专利技术提供所述组合物在抑制辣椒疫霉菌以及由辣椒疫霉菌所致的植物病害中的应用。
[0027]进一步地，所述应用包括：
[0028](1)将所述组合物配制成溶液施于植物根际周围的土壤或育苗基质中；或，
[0029](2)将所述组合物配制成溶液对植株进行灌根处理；或
[0030](3)将所述组合物配制成溶液进行浸种处理；或
[0031](4)用所述组合物配制成溶液喷洒植株。
[0032]本专利技术中，所述植物包括但不限于辣椒、拟南芥。
[0033]本专利技术首次发现辣椒疫霉效应因子NLP779诱导辣椒生成抗菌肽，对TMT组学结果中的上调蛋白进行结构域富集分析，发现一类Knot1抗菌肽均上调表达，将外源纯化后的Knot1(即CaKnot1
‑
U5蛋白)加入辣椒疫霉菌游动孢子中，能够抑制游动孢子活性、芽管伸长及附着孢形成。而将辣椒疫霉效应因子NLP779喷洒于辣椒植株后能够引起辣椒免疫反应，并抑制辣椒疫霉菌的侵染。NLP779与CaKnot1
‑
U5搭配使用能够更好地防治辣椒疫霉菌。
附图说明
[0034]图1为本专利技术较佳实施例中NLP779在辣椒疫霉菌生活史的不同阶段的表达情况。
[0035]图2为本专利技术较佳实施例中NLP779结构域预测。
[0036]图3为本专利技术较佳实施例中NLP779的核苷酸序列和氨基酸序列。
[0037]图4为本专利技术较佳实施例中NLP779PCR扩增结果。
[0038]图5为本专利技术较佳实施例中NLP779诱导本氏烟细胞死亡(通过使用GFP的蛋白质印迹法检测每种蛋白质的预期大小，蛋白质大小标记物以kDa表示)。
[0039]图6为本专利技术较佳实施例中NLP779基因沉默。(A)RT
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qPCR检测沉默转化子的沉默效率(***P<0.001)；(B)WT与沉默转化子生长速率，比例尺为1cm；(C)WT与沉默转化子直径统计(ns P>0.05)。
[0040]图7为本专利技术较佳实施例中NLP779沉默转化子毒力测定。(A)WT和沉默转化子侵染辣椒叶片60h状态(紫外灯下)，比例尺为1cm；(B)侵染辣椒叶片病斑直径统计(ns P>0.05)；(C)侵染辣椒叶片qPCR检测辣椒疫霉菌生物量(ns P&g本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.CaKnot1
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U5蛋白，其特征在于，其为：(A)由SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(B)SEQ ID NO:4所示序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等功能的由(A)衍生的蛋白质。2.融合蛋白，其特征在于，其为包含促溶标签的CaKnot1
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U5蛋白；其中，所述促溶标签选自MBP、SUMO、GST、TRX；所述CaKnot1
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U5蛋白同权利要求1中所述。3.根据权利要求2所述的融合蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。4.编码权利要求1所述蛋白或权利要求2或3所述融合蛋白的核酸分子。5.含有权利要求4所述核酸分子的生物材料，其特征在于，所述生物材料为重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、病毒载体或工程菌。6.权利要求1所述蛋白或权利要求2或3所述融合蛋白以及表达所述蛋白或融合蛋白的原核或真核表达系统在抑制辣椒疫霉菌以及由辣椒疫霉菌所致的植物病害中的应用。7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述应用包括：(1)将所述蛋白或融合蛋白配制成蛋白溶液，或者将表达所述蛋白或融合蛋白的大肠杆菌菌液或其稀释液施于植物根际周围的土壤或育苗基质中；或，(2)将所述蛋白或融合蛋白配制成蛋白溶液，或者将表达所述蛋白或融合蛋白的大肠杆菌菌液或其稀释液对植株进行...

【专利技术属性】
技术研发人员：孟哲，赵文龙，潘敏，祁佳栋，耿灿，王石，张修国，
申请(专利权)人：山东师范大学，
类型：发明
国别省市：