不结球白菜BcERF070基因的基因工程应用制造技术

不结球白菜BcERF070基因调控不结球白菜Vc含量中的应用，本研究验证了BcERF070基因在不结球白菜Vc合成途径中的重要作用，构建CRISPR/Cas9基因编辑载体并转化到不结球白菜中，与非转基因植株相比，转基因植株的BcERF070基因序列发生碱基替换，植株Vc含量随之下降，并进而实现了提早不结球白菜开花时间、缩短育种周期、提高蔬菜品质，为创造不结球白菜新种质提供技术支持。白菜新种质提供技术支持。白菜新种质提供技术支持。

【技术实现步骤摘要】
不结球白菜BcERF070基因的基因工程应用


[0001]本专利技术属于分子生物学和生物
，具体涉及不结球白菜BcERF070基因调控不结球白菜Vc含量中的应用。

技术介绍

[0002]植物中维生素C(vitamin C，以下简称Vc)又称L
‑
抗坏血酸(L
‑
ascorbic acid，AsA)，在植物自身的抗氧化系统、光合保护以及调节生长发育中起到至关重要的作用，更为我们提供了丰富而方便的Vc补充。针对植物中的Vc合成的研究一直在进行中，通过基因工程技术提高AsA含量，探索基因功能是当前研究的热门方向。
[0003]不结球白菜在植物学上属于十字花科芸薹属植物，常规育种方法受限于种质资源的匮乏，难有作为，而植物基因工程技术可以突破物种间的界限，转移外源的有用基因，为芸薹属作物改良提供了新途径。芸薹属植物常用的遗传转化方法有农杆菌介导法、基因枪法、电击法等，其中农杆菌介导法应用最广泛，方法最成熟。农杆菌介导法转基因技术就是使分别含有Ti质粒和Ri质粒的根癌农杆菌和发根农杆菌携带目的基因，利用农杆菌诱导植物伤口产生冠瘿瘤或发状根的特性，将质粒上T
‑
DNA携带的目的基因插入到植物基因组中，再通过组织培养技术，再生出携带目的基因的转基因植株的技术方法。1988年，Zhang等发现芸薹属作物的再生与基因型密切相关。1990年Boulter在甘蓝型油菜的遗传转化研究中发现，根癌农杆菌有比发根农杆菌更高的转化频率，从此芸薹属蔬菜遗传转化体系的研究开始不断取得新进展，积累了丰富的研究材料。
[0004]如何通过基因工程获得突变体验证基因功能、调控不结球白菜中的VC含量，进而创造不结球白菜新种质具有重要的现实意义。

技术实现思路

[0005]本研究验证了该基因在Vc合成途径中的重要作用，成功获得该基因的基因编辑突变体植株，与野生型植株相比，基因编辑植株的BcERF070基因序列碱基发生替换，植株Vc含量随之下降。为之后通过基因工程提早不结球白菜开花时间、缩短育种周期、创造蔬菜新种质提供了理论依据和实践依据。
[0006]本专利技术的第一个目的是提供不结球白菜BcERF070基因的基因工程应用，敲除BcERF070基因，能够降低不结球白菜Vc含量。
[0007]本专利技术的第二个目的是提供不结球白菜BcERF070基因的基因工程应用，敲除BcERF070基因，能够提早不结球白菜开花时间。
[0008]进一步的，前述应用中，所述BcERF070基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示：ATGAAGCGAATCGTGAGGATATCATTCACCGACGTGGAGGCCACCGATTCTTCCAGCAGCGAAGACGATCAGACGAACACCGAATCACCGTCGCCACGAAAAGGGAAGAGGTTCGTCAAGGAGATCGTCATCGACCCATCCGATTCCGCCGAGGTGAGAAAGACGCGGTTTAAGATCAGGATTCCGGCGAGGCTTACGAAGAAGTTCCGAGGTGTGAGGCAGAGGCCGTGGGGGAAATGGGCGGCTGAGATCAGGTGCGGTAAAGCTCACGGTGGAATTCGCAACGGGGGACCTGTTCGTCTTTGGCTTG
GGACATTCGAAACCGCCGAGGAAGCTGCTTTGGCTTACGACAAGGCCGCGATTCGGCTTATTGGGCCTCACGCGCCGATCAATTTCGGCCCAGAATCTCCGGCTGTGAAGCAAGATTCCGTTGCGGGGGACTGA
[0009]进一步的，前述应用中，所述敲除BcERF070基因为将BcERF070基因CRISPR/Cas9载体导入不结球白菜，导致BcERF070基因序列改变，失去作用。
[0010]在某一个特定的实施例中，敲除BcERF070基因具体包括如下步骤：
[0011](1)BcERF070基因CRISPR载体构建
[0012]根据在线网站http://cbi.hzau.edu.cn/cgi
‑
bin/CRISPR设计sgRNA，将SEQ ID NO.1所示BcERF070的序列输入网站，得到一系列长为20bp的序列，设计sgRNA：GTGTGAGGCAGAGGCCGTGG(SEQ ID NO.2)，5
’‑
NGG
‑3’
为PAM(所述N代表任一碱基)。
[0013]上述SEQ ID NO.1所示BcERF070基因核苷酸序列中，下划线处为SEQ ID NO.2所示sgRNA，加粗处为PAM。
[0014]选择PAM结构前二十个碱基作为前引物，反向互补作为后引物，设计sgRNA引物，分别是，从5
’‑3’
：
[0015]sgRNA
‑1‑
F:GATTGTGTGAGGCAGAGGCCGTGG(SEQ ID NO.3)
[0016]sgRNA
‑1‑
R:AAACCCACGGCCTCTGCCTCACAC(SEQ ID NO.4)
[0017]5μl sgRNA
‑1‑
F+5μl sgRNA
‑1‑
R直接退火；
[0018]程序：第一步，95℃，3min；第二步，95℃，1min；第三步，回到步骤二，每次下降1℃，重复40次；第四步，55℃，30min；第五步，55℃，1min；第六步，回到步骤五，每次下降1℃，重复30次；最后4℃保存。
[0019]将退火产物连到Bpi 1单酶切的PMD18
‑
T质粒(含有psgR
‑
Cas9
‑
At，由浙江大学提供)上，体系为退火产物2μl、载体2μl、5
×
buffer 2μl、T4连接酶1μl、H2O 3μl，连接产物转化大肠杆菌；提取带有片段的PMD18
‑
T质粒后酶切(酶切位点Kpn1和HindIII)连接到Kpn1和HindIII酶切过的pCAMBIA1301上，连接产物转化大肠杆菌；测序鉴定确保表达载体中编码区阅读框架正确，得到CRISPR载体。
[0020](2)植物表达载体质粒转化农杆菌
[0021]将(1)得到的CRISPR载体分别加入到感受态农杆菌，混匀后冰浴10min，随后液氮速冻5min，迅速移至37℃水浴中5min，冰浴5min，加入900ul新鲜的LB液体培养基，于28℃，250rpm振荡培养2～3h，然后6000rpm离心5min，留取100ul左右上清吹打重悬菌液，涂布于含50mg/L卡那霉素和20mg/L利福平的LB固体培养基，28℃暗培养2
‑
3d直到平板上长出单菌落，PCR鉴定后获得携带有CRISPR/Cas9基因编辑载体的农杆菌GV3101。
[0022](3)农杆菌介导法转本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.不结球白菜BcERF070基因的基因工程应用，其特征在于，敲除BcERF070基因，能够降低不结球白菜Vc含量。2.不结球白菜BcERF070基因的基因工程应用，其特征在于，敲除BcERF070基因，能够提早不结球白菜开花时间。3.根据权利要求1或2所述的应用，其特...

【专利技术属性】
技术研发人员：李英，张宇祺，虞章红，刘同坤，张昌伟，侯喜林，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：