一种抗人ＢＡＦＦ单克隆抗体的重链和轻链可变区制造技术

本发明专利技术公开了一种抗人ＢＡＦＦ单克隆抗体的重链和轻链的可变区，该抗人ＢＡＦＦ单克隆抗体为ＦＭＭＵ－ＢＡＦＦ－４，其单克隆抗体可变区基因序列如ＳＥＱ?ＩＤ?ＮＯ．３和ＳＥＱ?ＩＤ?ＮＯ．４所示；其单克隆抗体可变区氨基酸序列如ＳＥＱＩＤ?ＮＯ．１和ＳＥＱ?ＩＤ?ＮＯ．２所示。本发明专利技术用重组人ＢＡＦＦ免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，制备小鼠抗人ＢＡＦＦ单克隆抗体，克隆并从中筛选出能分泌特异性的人ＢＡＦＦ单克隆抗体ＦＭＭＵ－ＢＡＦＦ－ＮＯ．４的杂交瘤细胞株，并克隆该单克隆抗体轻链和重链可变区基因，获得该单克隆抗体轻链和重链可变区基因序列和氨基酸序列，以及可变区的ＣＤＲ序列；并确认氨基酸序列和基因序列的惟一性。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物医学
，涉及一种单克隆抗体，特别涉及一种抗人BAFF单 克隆抗体的重链和轻链可变区，包括其氨基酸序列及其核苷酸序列。
技术介绍
自身免疫性疾病(autoimmune diseases)是指机体对自身抗原发生免疫反应而导 致自身组织损害所引起的疾病，是严重危害人类健康的疾病。常见的自身免疫性疾病有系 统性红斑狼疮(SLE)、口眼干燥综合征(SS)、类风湿性关节炎(RA)等。针对自身免疫性疾 病的治疗手段目前仍处于研究和探索阶段，主要依赖药物如免疫抑制剂、理疗及外科治疗 等手段，但是毒副作用较大且无法根治。因此结合基因工程和蛋白质工程技术的靶向抗体 药物治疗正成为新兴研究领域，有望为包括系统性红斑狼疮在内的自身免疫性疾病治疗提 供新的策略。B淋巴细胞刺激因子(B cell activating factor, BAFF)是1999年发现的新分 子，属于肿瘤坏死因子超家族成员(TNFSF)。BAFF分子在B细胞发育、功能调节和自身免 疫性疾病的发病中发挥重要作用，BAFF缺陷或过量表达均能引起机体免疫失衡，从而诱发 多种疾病，且可能与某些自身免疫性疾病的发生有关。实验表明(Yoshimoto K et al,Int Immunol. 18(7) :1189_96.)，在系统性红斑狼疮、口眼干燥综合征和类风湿性关节炎等病人 血清中sBAFF水平明显升高，进一步实验证实了 BAFF分子过表达密切参与了系统性红斑狼 疮、口眼干燥综合征、类风湿性关节炎等多种自身免疫性疾病的发生和发展。基于对BAFF 分子结构及其在生理和病理条件下所起作用的认识，人们已开始尝试以BAFF及其受体作 为靶点进而阻断BAFF的生物学活性来合理设计治疗某些相关疾病的新措施，为自身免疫 性疾病的治疗提供新方法或新型药物。目前阻断BAFF生物学活性的制剂主要有抗BAFF抗体和BAFF的可溶型受体两 大类，其中抗 BAFF 抗体包括 lymphostat-B、EGFP/scFv F8、anti-BAFFscFv、anti-BAFF scFv-Fc等，但是前三类抗体只能识别游离BAFF，不能识别细胞膜上的BAFF ；后一类抗体虽 然对游离的BAFF和细胞膜上的BAFF都能识别但是亲和力较低，阻碍其进一步应用。因此 制备新型的BAFF治疗性抗体具有十分重要的理论和实际意义。抗体单体分子是由两条相同的重链(H链)和两条相同的轻链(L链)，通过链间二 硫键连接而成的四肽链结构。H链和L链包括氨基(N)端和羧基(C)端，靠近N端的可变区 (V区)由高变区/互补决定区(HVR/CDR)和骨架区(FR)组成；靠近C端为恒定区(C区)。 重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)形成的蛋白质折叠是抗原结合部位，其中的CDR/HVR 是抗体与抗原决定基互补结合的部位，C区引发抗原抗体识别后的反应。抗体根据FR/C区 不同可分为人源、鼠源等，鼠源性抗体在人体内使用时具有免疫原性，易引起人体的免疫反 应，这些免疫反应可引起对鼠源性抗体的清除以及免疫复合物介导的超敏反应。为了克服 鼠源性抗体的缺陷，需要构建特异性的嵌合抗体、单链抗体或人源化抗体等基因工程抗体。在构建特异性的嵌合抗体、单链抗体或人源化抗体等基因工程抗体过程中，最为重要的是获得具有良好特异性、亲和力和中和活性的鼠源性亲本抗体，克隆其轻链和重链 可变区基因，然后将可变区基因克隆入相应载体构建相应的基因工程抗体重组DNA，进而表 达各种类型的基因工程抗体。因此，筛选出特异性的鼠源性单克隆抗体的杂交瘤细胞克隆， 从中克隆出抗体的重链和轻链可变区基因，分析其氨基酸序列，是进一步构建高亲和力、特 异性和具有中和活性的基因工程抗体的前提。
技术实现思路
本专利技术解决的问题在于提供一种抗人BAFF单克隆抗体的重链和轻链可变区，包 括其基因及其氨基酸序列，为构建高亲和力、特异性和中和活性的抗人BAFF嵌合或人源化 基因工程抗体提供支持。本专利技术是通过以下技术方案来实现一种抗人BAFF单克隆抗体的重链和轻链的可变区，轻链可变区的3个互补决定区 (CDR)序列分别为CDR1:Lys-Ser-Leu-Leu-His-Ser-Asn-Gly-Asn-Thr-Tyr ；CDR2 :Arg-Met-Ser ；CDR3 :Met-Gln-His-Leu-Glu-Tyr-Pro-Phe-Thr ；重链可变区的3个互补决定区(⑶R)序列分别为CDR1:Gly-Phe-Thr-Phe-Ser-Ser-Tyr-Asp ；CDR2 :IIe-Ser-Ser-Gly-Gly-Ser-Tyr-Thr ；CDR3 :Ala-Ser-Asp-Gly-Val-Trp-Tyr-Ala-Met-Asp-Tyr。所述的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示，重链可变区的氨基酸序列 如 SEQ ID NO. 2 所示。所述的编码轻链可变区的基因序列如SEQ ID NO. 3所示，编码重链可变区的基因 序列如SEQ ID NO. 4所示。抗人BAFF单克隆抗体的重链和轻链的可变区应用于以人BAFF分子为靶点的基因 工程抗体或疫苗的制备。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益的技术效果1、本专利技术所述的抗人BAFF单克隆抗体被命名为FMMU-BAFF-4，该抗体是具有高 度特异性的抗人BAFF单克隆抗体；经过间接ELISA检测、流式细胞仪检测证实单克隆抗体 FMMU-BAFF-4具有高效价，能够与BAFF分子具有高的亲和力；而且与可溶性的和细胞表面 表达的BAFF分子能够特异性的结合。2、本专利技术克隆了单克隆抗体FMMU-BAFF-4的轻链、重链可变区基因和氨基酸序 列，序列分析证实了该抗体序列的惟一性。3、分析获得轻链、重链可变区的⑶R区，在此基础上为构建高亲和力的抗人BAFF 嵌合或人源化基因工程抗体提供支持。附图说明图1是单克隆抗体FMMU-BAFF-1 7与sBAFF的间接ELISA检测结果图；图2是FMMU-BAFF-1 7单克隆抗体与转染BAFF-YFP质粒的293T细胞表面BAFF分子结合的流式细胞术检测结果图，其中，图2a为阴性对照结果图，图2b为空白对照，图2c 为单抗检测结果图；图3是FMMU-BAFF-4单克隆抗体轻链可变区基因同源性序列检测结果图；图4是FMMU-BAFF-4单克隆抗体重链可变区基因同源性序列检测结果图；图5是FMMU-BAFF-4单克隆抗体轻链可变区氨基酸同源性序列检测结果图；图6是FMMU-BAFF-4单克隆抗体重链可变区氨基酸同源性序列检测结果图。具体实施例方式可变区基因的完整核苷酸序列，尤其是其功能性片段的核苷酸序列(如CDR等) 以及抗体可变区的氨基酸序列，是嵌合抗体、单链抗体或人源化抗体构建的基础。为此，申 请人用重组人BAFF免疫BALB/c小鼠，制备小鼠抗人BAFF单克隆抗体，克隆并从中筛选出 能分泌特异性的人BAFF单克隆抗体FMMU-BAFF-N0. 4的杂交瘤细胞株，纯化制备了该单克 隆抗体并验证了其高亲和性和特异性。并克隆该单克隆抗体轻链和重链可变区基因，获得该单克隆抗体轻链和重链可变 区基因序列和氨基酸序列，以及可变区的CDR序列；并确认氨基酸序列和基因序列的惟一 性。所本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抗人ＢＡＦＦ单克隆抗体的重链和轻链的可变区，其特征在于，轻链可变区的３个互补决定区（ＣＤＲ）序列分别为：　　ＣＤＲ１：Ｌｙｓ－Ｓｅｒ－Ｌｅｕ－Ｌｅｕ－Ｈｉｓ－Ｓｅｒ－Ａｓｎ－Ｇｌｙ－Ａｓｎ－Ｔｈｒ－Ｔｙｒ；　　ＣＤＲ２：Ａｒｇ－Ｍｅｔ－Ｓｅｒ；　　ＣＤＲ３：Ｍｅｔ－Ｇｌｎ－Ｈｉｓ－Ｌｅｕ－Ｇｌｕ－Ｔｙｒ－Ｐｒｏ－Ｐｈｅ－Ｔｈｒ；　　重链可变区的３个互补决定区（ＣＤＲ）序列分别为：　　ＣＤＲ１：Ｇｌｙ－Ｐｈｅ－Ｔｈｒ－Ｐｈｅ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ｔｙｒ－Ａｓｐ；　　ＣＤＲ２：ＩＩｅ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｔｙｒ－Ｔｈｒ；　　ＣＤＲ３：Ａｌａ－Ｓｅｒ－Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｖａｌ－Ｔｒｐ－Ｔｙｒ－Ａｌａ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ－Ｔｙｒ。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：金伯泉，陈丽华，肖黎明，宋朝君，龚玖瑜，
申请(专利权)人：中国人民解放军第四军医大学，
类型：发明
国别省市：87[中国|西安]