本发明专利技术公开的一种调控水稻耐铝性的基因OsAlR2的分离克隆、功能验证及其在水稻耐铝育种中的应用，属于植物基因工程领域，该基因OsAlR2的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，氨基酸序列如SEQ IDNo.2所示。本发明专利技术还公开了敲除所述基因OsAlF1的突变体J137，所述突变体显著降低了水稻对铝毒的耐受性，为研究OsAlR2调控水稻耐铝机制提供了重要的基因资源。本发明专利技术还提供了上述基因在水稻耐铝育种中的应用，为培育优良耐铝水稻品种提供基因资源。育优良耐铝水稻品种提供基因资源。育优良耐铝水稻品种提供基因资源。
【技术实现步骤摘要】
调控水稻耐铝性的基因OsAlR2及其应用
[0001]本专利技术涉及植物基因工程
，更具体地，涉及一种调控水稻耐铝性的基因OsAlR2及其应用。
技术介绍
[0002]可溶性铝离子的普遍存在是全球酸性土壤作物生产的主要限制因素。在pH值正常的土壤中，铝通常会被不溶性化合物如硅酸盐、硫化物和二氧化硅等固定，对植物没有毒性。但在pH≤5.5的酸性土壤中，铝以游离铝离子的形式被植物根系吸收，对植物产生毒害作用，其中三价Al
3+
毒性最大。
[0003]近年来，由于过量施用氮肥、施肥结构不合理、工业污染造成的酸雨和降水量大灌排不畅等造成的土壤酸化现象普遍发生，已成为制约农业种植发展的一大难题。铝作用于植物的根尖，其中对根冠和分生区毒害作用最大，可溶性的Al
3+
对植物最具毒性，在微摩尔水平下就能迅速抑制根系伸长，最主要的特征就是根系主轴生长受到抑制，根尖、侧根变得短粗且脆，根毛数量大大减少，根尖表皮细胞的体积缩小，严重时可使表层细胞破坏，根冠脱落，因此植物根尖被认为是铝毒性的关键部位。水稻(Oryza sativa)是世界上最重要的粮食作物之一。在酸性土壤中，微摩尔级Al
3+
能在短时间内对水稻根系产生毒害作用，水稻生长受到抑制，根系发育不良，吸收困难、长势变弱，加重病虫害发生程度，导致籽粒产量和品质下降。
[0004]耐铝毒水稻品种的培育是解决土壤酸化带来的铝毒害问题的有效途径。因此发掘和鉴定水稻铝抗性相关候选基因，阐明其在铝毒胁迫下的生理和分子机制，为培育耐铝水稻品种提供基因资源尤为重要。
[0005]尽管目前已定位、克隆了几个耐铝相关的基因，但由于耐铝机制的复杂性，定位和克隆的基因还远远不能揭示水稻耐铝的分子机制，限制了这些基因在耐铝育种中的应用。因此亟需在广泛的水稻种质资源中挖掘耐铝基因资源，鉴定和克隆更多新的耐铝基因，为进一步探索水稻铝胁迫响应的分子机制和培育耐铝水稻品种奠定基础。
技术实现思路
[0006]有鉴于此，本专利技术的主要目的在于提供一种调控水稻耐铝性能的基因OsAlR2及其在水稻耐铝育种中的应用，通过定位和克隆水稻中OsAlR2基因，获得了其核苷酸序列和蛋白质的氨基酸序列。
[0007]本专利技术提供了一种调控水稻耐铝性的基因OsAlR2，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
[0008]优选的，所述水稻OsAlR2基因以纯合形式存在于水稻基因组中以提高植株的耐铝毒能力。
[0009]本专利技术中所述OsAlR2基因序列通过如下方法获得：
[0010]从培育的水稻植株的叶片中提取DNA,用PCR引物即OsAlR2pF引物和OsAlR2pR引
物，进行PCR扩增，经测序，获得OsAlR2基因核苷酸序列。
[0011]由OsAlR2基因编码的蛋白质包含有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。
[0012]其中，OsAlR2pF引物序列为如SEQ ID NO：3所示，具体为：5
’‑
GCAGCTCTACATTGCGTACT
‑3’
；
[0013]所述OsAlR2pR引物序列为如SEQ ID NO：4所示，具体为：5
’‑
TGCCAATTAATCCAAGCCCG
‑3’
。
[0014]具体PCR反应体系采用50μL体系：DNA模板2μL，OsAlR2pF引物(10μmol/L)2μL，OsAlR2pR引物(10μmol/L)2μL，Taq Mix25μL，加ddH2O补足50μL。
[0015]PCR扩增程序如下：94℃预变形5min、94℃变性30s、54℃～60℃退火30s、72℃延伸1min，30～35个循环、72℃延伸10min。
[0016]具体培育方法为：打破休眠并经过消毒发芽的水稻种子，在28℃、14小时光照，10小时黑暗的条件下蒸馏水正常培养11d，第12d用含500μMCaCl2(pH＝4)的Yoshida营养液预处理24h，第13d用含100μMAlCl3(500μMCaCl2(pH＝4))的Yoshida营养液处理48h；结合根长、株高、根系中铝离子含量等参数综合评价水稻耐铝性。
[0017]本专利技术还提供了含有上述基因的重组载体、含有上述基因的质粒，以及含有上述基因或载体的工程菌或宿主细胞。所述工程菌和宿主细胞可理解为本领域技术人员在转基因过程中所使用的的工程菌或宿主细胞。在优选的技术方案中，所述宿主细胞是含有所述基因的靶标序列的大肠杆菌细胞、农杆菌细胞或植物细胞。随着科技发展，所述工程菌和宿主细胞的选择也许会发生变化，或非转基因目的的应用领域，也同样涉及载体和工程菌的利用，但只要含有本专利技术所述基因或本专利技术所述的载体，均在本专利技术的保护范围内。
[0018]本专利技术还提供了上述基因的应用，所述应用包括以下中的一种或多种：
[0019]1)用于水稻的耐铝育种；
[0020]2)通过使水稻中上述OsAlR2基因过表达，提高水稻耐铝能力；
[0021]3)降低水稻根系中的铝含量。
[0022]进一步地，本专利技术提供了利用荧光定量RT
‑
PCR检测OsAlR2基因表达量的方法，包括以下步骤：
[0023]将耐铝材料和铝敏感材料的种子分别在28℃、14小时光照，10小时黑暗的条件下正常生长11d，处理组第12d用含500μM CaCl2(pH＝4)的Yoshida营养液预处理24h，第13d用含100μM AlCl3(500μM CaCl2(pH＝4))的Yoshida营养液处理48h；对照组在第12d至14d换为全营养液，每两天换一次营养液；
[0024]取上述耐铝材料和铝敏感材料根系提取总RNA，反转录后，获得cDNA，以cDNA为模板，用RT
‑
PCR引物即OsAlR2
‑
F引物和OsAlR2
‑
R引物扩增，检测OsAlR2基因的表达量。
[0025]其中，所述OsAlR2
‑
F引物的序列如SEQ ID NO：5所示，具体为：5
’‑
ACTCCTCCTTCCACTGCAAA
‑3’
；
[0026]所述OsAlR2
‑
R引物序列为如SEQ ID NO：6所示，具体为：5
’‑
GAACGGCAATTGGGATCCTG
‑3’
。
[0027]具体RT
‑
PCR反应体系如下：2
×
SYBR GreenPro Taq HS Premix10μL；cDNA 4μL；Primer F(10μM)0.8μL；Primer R(10μM)0.8μL；ROX Reference Dye(20μM)0.4μL；RNase free water to 20μL。
[0028]表达量计算方法采用...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种调控水稻耐铝性的基因OsAlR2，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。2.如权利要1所述基因编码的蛋白质，其特征在于，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。3.含有如权利要求1所述基因的重组载体、工程菌或宿主细胞。4.如权利要求1所述基因的应用，其特征在于，所述应用包括以下中的一种或多种：1)调控水稻对铝胁迫的抗性；2)培育抗铝胁迫或培育具有铝耐受性的水稻品种；3)降低水稻根系中的铝含量。5.一种用于检测权利要求1中所述基因的RT
‑
PCR引物，其特征在于，所述RT
...
【专利技术属性】
技术研发人员：赵明辉，姜思旭，冯晶，苏畅，王镜博，崔志波，江琳琳，费澄，陈温福，
申请(专利权)人：沈阳农业大学，
类型：发明
国别省市：
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