重组抗菌肽Sub168-1/3R、重组菌株、载体、制备方法及饲料添加剂技术

本发明专利技术涉及一种重组抗菌肽Sub168

【技术实现步骤摘要】
重组抗菌肽Sub168
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1/3R、重组菌株、载体、制备方法及饲料添加剂


[0001]本专利技术属于基因工程及生物
，具体涉及重组抗菌肽Sub168
‑
1/3R、重组菌株、载体、制备方法及饲料添加剂。

技术介绍

[0002]在动物养殖中，细菌性腹泻等细菌性疾病严重危害动物健康，对养殖造成重大损失。目前主要通过使用抗生素对其进行治疗及防治，但抗生素的过度使用及滥用不断造成耐药菌株及耐药性出现，进而威胁人类健康。抗菌肽(AMPs)是一类小分子的肽类物质，来源广泛，分子量小且具有广谱的抗菌活性。与传统的抗生素相比，抗菌肽属于天然的活性物质，无污染，不易产生耐药性，是一种极具潜力的抗生素替代品。但生物提取及化学合成等手段的制备方法成本高、效率低，不易实现大量制备，无法满足工业化生产的需求，因此实现抗菌肽的高效制备和生产的方法是研究的热点。
[0003]抗菌肽Sublancin168是枯草芽孢杆菌分泌的代谢物之一，具有特定的结构及一定的抗菌活性，但其抗菌特性还需进一步挖掘。其作为一种待开发的想应用于饲料行业的抗菌肽除需满足良好的抗菌活性外，还需具备较好的能够耐受工业化生产中造粒等高温加工过程的热稳定性、能够耐受动物胃蛋白酶从而发挥活性的消化酶稳定性、应用于动物饲料中生产和使用的安全性。因此，对畜禽动物养殖常见致病菌的抗菌活性、自身的热稳定性、胃蛋白酶稳定性及生产和自身的安全性均是抗菌肽应用为饲料添加剂的基础。
[0004]为满足工业化生产的需求，异源表达的制备方式被普遍采用。大肠杆菌、毕赤酵母等宿主工程菌株需要诱导剂诱导表达外源蛋白，生产的外源蛋白无法直接应用为饲料添加剂。而里氏木霉作为一种食品级安全菌株(GRAS)可以满足生产的外源蛋白的安全性要求，且还具有强启动子和蛋白质翻译后加工能力强等优点，可以为饲料添加剂的安全性奠定基础。大肠杆菌、沙门氏菌、产气荚膜梭菌是影响仔猪和幼鸡健康的常见致病性细菌，需要开发和挖掘能够抑制上述三种细菌且具有良好特性的抗菌肽。

技术实现思路

[0005]本专利技术针对上述技术问题提供一种重组抗菌肽Sub168
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1/3R、重组菌株、制备方法及其应用，以其作为饲料添加剂在饲料行业中的应用。
[0006]本专利技术是通过如下技术方案来实现的：
[0007]一种重组抗菌肽Sub168
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1/3R，所述重组抗菌肽Sub168
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1/3R的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；具体为：RLRKAQCAALWLQCASGGTIGCGGGAVACQ NY RQ FCR。
[0008]进一步，编码SEQ ID NO.1所述氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述SEQ ID NO.2是在原始氨基酸序列SEQ ID NO.3的抗菌肽Sublancin168基础上，翻译为编码的核苷酸序列，并进行该核苷酸片段的人工合成，对该人工合成的片段进行易错PCR反应获得的突变体，所述编码SEQ ID NO.3的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
[0009]所述SEQ ID NO.2为agattgagaaaggctcaatgtgctgctttgtggttgcaatgtgcttcaggaggtac tattggatgtggaggtggagctgttgcttgtcaaaactacagacaattttgtaga。
[0010]SEQ ID NO.3：GLGKAQCAALWLQCASGGTIGCGGGAVAC QNYRQFCR。
[0011]SEQ ID NO.4：ggattgggtaaggctcaatgtgctgctttgtggttgcaatgtgcttcaggaggtactattg gatgtggaggtggagctgttgcttgtcaaaactacagacaattttgtaga。
[0012]本专利技术还提供包含上述重组抗菌肽Sub168
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1/3R基因的里氏木霉重组表达载体。
[0013]本专利技术还提供包含上述重组抗菌肽Sub168
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1/3R的重组菌株，所述菌株为里氏木霉Tu6。
[0014]本专利技术还提供所述重组抗菌肽Sub168
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1/3R在饲料或饲料添加剂中的应用。
[0015]本专利技术还提供一种饲料添加剂，所述饲料添加剂中含有所述重组抗菌肽Sub168
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1/3R。
[0016]本专利技术还提供所述重组抗菌肽Sub168
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1/3R的制备方法，具体为：通过易错PCR反应扩增抗菌肽Sub168
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1/3R的基因片段，使用琼脂糖凝胶电泳检测该易错PCR片段，通过体外同源重组插入木霉表达载体，构建重组抗菌肽Sub168
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1/3R的重组表达载体；将重组表达载体采用聚乙二醇介导的原生质体转化法转入木霉Tu6，筛选阳性转化子及验证后，通过发酵表达获得重组抗菌肽Sub168
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1/3R。
[0017]本专利技术与现有技术相比的有益效果：通过易错PCR方法得到了一种重组抗菌肽Sub168
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1/3R，构建其在里氏木霉中的重组表达载体突变库；
[0018]本专利技术将重组抗菌肽Sub168
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1/3R在里氏木霉Tu6中异源表达，获得该重组抗菌肽Sub168
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1/3R表达产物，具备重组抗菌肽Sub168
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1/3R在里氏木霉Tu6中的制备方法；
[0019]本专利技术表征了重组抗菌肽Sub168
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1/3R表达产物的抗菌活性，其对大肠杆菌、沙门氏菌及产气荚膜梭菌均有抑制作用。且对比原始序列的抗菌肽，重组抗菌肽Sub168
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1/3R具有更强的对革兰氏阴性菌的抗菌活性；
[0020]本专利技术所述的重组抗菌肽Sub168
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1/3R具有良好的热稳定性、耐酸和耐胃蛋白酶特性及较低的溶血活性，上述特性有利于其在饲料及饲料添加剂中的应用。
附图说明
[0021]图1为重组抗菌肽Sub168
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1/3R热稳定性示意图；
[0022]图2为重组抗菌肽Sub168
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1/3RpH稳定性示意图；
[0023]图3为重组抗菌肽Sub168
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1/3R的胃蛋白酶酶稳定性示意图；
[0024]图4为重组抗菌肽Sub168
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1/3R的胰蛋白酶稳定性示意图。
具体实施方式
[0025]下面通过实施例来对本专利技术的技术方案做进一步解释，但本专利技术的保护范围不受实施例任何形式上的限制。
[0026]PDA固体培养基的成分及终浓度马铃薯浸粉5.0g/L，葡萄糖20.0g/L，琼脂20.0g/L，氯霉素：0.1g/L。
[0027]实施例1重组抗菌肽Sub168...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种重组抗菌肽Sub168
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1/3R，其特征在于，所述重组抗菌肽Sub168
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1/3R的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.根据权利要求1所述的重组抗菌肽Sub168
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1/3R，其特征在于，编码SEQ ID NO.1所述氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。3.权利要求1所述重组抗菌肽Sub168
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1/3R在制备饲料或饲料添加剂中的应用。4.一种饲料添加剂，其特征在于，所述饲料添加剂中含有权利要求1所述重组抗菌肽Sub168
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1/3R。5.重组抗菌肽Sub168
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1/3R...

【专利技术属性】
技术研发人员：牟海津，王双童，梁青平，赵迎军，朱常亮，李东钰，
申请(专利权)人：中国海洋大学，
类型：发明
国别省市：