NMNAT1基因修饰间充质干细胞的设计方法、制备方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种NMNAT1基因修饰间充质干细胞的设计方法、制备方法及其应用。以293T细胞cDNA为模板，设计扩增引物，通过PCR扩增人NMNAT1基因CDS区片段，再利用T4连接酶与pCDH

【技术实现步骤摘要】
NMNAT1基因修饰间充质干细胞的设计方法、制备方法及其应用


[0001]本专利技术属于干细胞研究与应用
，具体涉及一种NMNAT1基因修饰间充质干细胞的设计方法、制备方法及其应用。
技术背景
[0002]我国老年人的数量规模非常巨大，老年人的健康问题是我们面临的巨大挑战。2020年全国人口普查显示，在2020年我国超过60岁的老人有2.6亿，占全国人口18.70％，而这个比例仍在不断增加。老年人的数量在国际上也表现为相同的趋势。衰老是人类大多数慢性疾病的关键风险因素，包括心血管疾病、糖尿病、阿兹海默、癌症和神经退行性疾病等。据统计，有超过75％的老年人患有至少一种慢性疾病。随着全球老年人口数量的不断攀升，促进健康老龄化过程，预防衰老相关的健康问题，正确认识衰老机制，制定有效且负担得起的抗衰老干预策略，具有重大的社会意义和巨大的经济效益，如何逆转衰老已成为临床和生物学研究中面临的最大挑战之一。
[0003]间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)是一类具有自我更新，多向分化潜能的细胞类群，具有低免疫原性、多来源途径、多分化潜能及强大的旁分泌功能等特征。1995年，第一例MSCs疗法进入临床应用。迄今为止，在ClinicalTrials.gov上登记的关于MSCs的临床研究将近1000项，涉及上百种疾病，其中神经系统、代谢疾病和骨科疾病是主要的研究领域。众多临床证据表明了基于MSCs的疗法具有良好的安全性和有效性。自第一次将MSCs用于疾病治疗已有20余年，但干细胞疗法的临床化仍在路上。当前，诸多问题困扰着干细胞疗法的临床推进。
[0004]当前，MSCs治疗尚处在初级阶段。限制MSCs疗法发展的主要关键因素包括：
[0005](1)高昂的技术成本。当前MSCs疗法依赖于严格的无菌操作环境和具有丰富经验的细胞制备人员。此外，MSCs应用还需有资质的三甲医院方可进行。
[0006](2)稀缺的时间成本。MSCs制备需3～5天的复苏扩增周期。许多急性期疾病发现晚，病程急，导致MSCs治疗不能及时介入，错过了治疗的黄金时刻。
[0007](3)批次质量不稳定性。当前MSCs治疗主要使用3～5代的原代MSCs，不同批次分离扩增的MSCs或不同的操作人员均可能造成MSCs质量不佳或衰老，导致治疗效果差。MSCs的质量评估尚没有确切标准，质量评估困难。
[0008](4)缺乏明确的治疗靶点。当前MSCs疗法机制解释集中于广泛的微环境调节作用以及旁分泌作用，尚没有明确的治疗机制网络，从而限制了MSCs的广泛应用。
[0009]烟酰胺单核苷酸腺苷酸转移酶1(Nicotinamide nucleotide adenylyltransferase1，NMNAT1)是酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)代谢途径中的关键酶，在NAD代谢的Preiss
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Handler途径和补救合成途径中发挥着关键作用。已有研究表明，NMNAT1能够通过多种途径缓解阿兹海默、糖尿病肾病等衰老相关疾病病理过程中发生的改变，提供氧化应激保护、肾脏保护及神经元保护作用，在抗衰老中显示出巨大潜力。NMNAT1的缺失会
降低核NAD，激活p53，在阿兹海默(Alzheimer disease，AD)病的研究发现，NMNAT1改善了认知障碍的实质性行为。也有效地控制了SOD1的激活，显著降低了多种AD相关的病原醇，具有巨大的神经保护潜力。

技术实现思路

[0010]有鉴于此，本专利技术一种NMNAT1基因修饰间充质干细胞的设计方法、制备方法及其应用，旨在通过研发新型干细胞制剂以解决MSCs临床化面临的一系列迫切困境。
[0011]为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案为：一种NMNAT1基因修饰间充质干细胞的设计方法，其特征在于，步骤为：
[0012]1)以人源cDNA为模板，通过PCR技术克隆扩增出包含NMNAT1基因的CDS区全长片段并附加多克隆位点序列或同源臂；
[0013]2)通过直接合成、同源重组、吉布森装配或酶切连接等方式构建成的包含以上元素的基因敲入表达载体。
[0014]上述间充质干细胞为哺乳动物表达干细胞。
[0015]高表达人NMNAT1基因的间充质干细胞的制备方法，其特征在于，步骤为：
[0016]1)通过慢病毒载体包装293T细胞，收集含有病毒颗粒的细胞上清液；
[0017]2)使用含有病毒颗粒的细胞上清液感染间充质干细胞，构建高表达NMNAT1基因的间充质干细胞。
[0018]NMNAT1基因修饰间充质干细胞在延缓哺乳动物衰老中的应用。
[0019]NMNAT1基因修饰间充质干细胞在延缓小鼠衰老中的方法，其特征在于：步骤为：
[0020]1)对衰老动物给与高表达NMNAT1的间充质干细胞2*106个/只，每周1次，共3次，最后一次治疗一周后检测其氧化应激水平及组织病理变化；
[0021]2)通过小鼠血清氧化应激水平数据分析鉴定高表达NMNAT1的间充质干细胞对衰老动物的治疗作用。
[0022]与现有技术相比，本专利技术具有以下优点：
[0023]1、本专利技术通过在MSCs中过表达NMNAT1基因，促进了MSCs的体外扩增能力，进一步缩短了MSCs制备所需时间，推进了干细胞治疗的临床使用。
[0024]2、本专利技术通过在MSCs中过表达NMNAT1基因，促进了MSCs的体外活力，进而使MSCs具有更好的治疗效果。
[0025]3、本专利技术通过在MSCs中过表达NMNAT1基因，促进了MSCs的质量稳定性，NMNAT1促进了MSCs对体外培养不利环境的抵抗作用，使MSCs在培养过程中质量均一。
[0026]4、本专利技术提供的NMNAT1基因修饰MSCs具备细胞体外活力好，细胞质量高，制备时间短等极强优势。因此，本专利技术特别有利于破解目前MSCs临床治疗的困局。
附图说明
[0027]图1为NMNAT1过表达质粒的构建图；其中，
[0028]A为设计pCDH
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CMV
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EF1
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copGFP
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T2A
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Puro质粒图谱；
[0029]B为pCDH
‑
CMV
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EF1
‑
copGFP
‑
T2A
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Puro质粒利用BamH I和EcoR1 I酶进行双酶切，鉴定产物经1％琼脂糖凝胶电泳结果。
[0030]图2为建立NMNAT1基因修饰的MSC细胞株；其中，
[0031]A为过表达NMNAT1后的稳转细胞株图片，上方CMV为空载对照，下方为NMNAT1过表达细胞株；
[0032]B为qPCR检测过表达效率的柱状图，内参为GAPDH，过表达效率为2000倍。
[0033]图3为NMNAT1基因修饰MSC细胞株特性；其中，...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种NMNAT1基因修饰间充质干细胞的设计方法，其特征在于，步骤为：1)以人源cDNA为模板，通过PCR技术克隆扩增出包含NMNAT1基因的CDS区全长片段并附加多克隆位点序列或同源臂；2)通过直接合成、同源重组、吉布森装配或酶切连接等方式构建成的包含以上元素的基因敲入表达载体。2.根据权利要求1所述的一种NMNAT1基因修饰间充质干细胞的设计方法，其特征在于，所述的间充质干细胞为哺乳动物表达干细胞。3.如权利要求1所述的高表达人NMNAT1基因的间充质干细胞的制备方法，其特征在于，步骤为：1)通过慢病毒载体包...

【专利技术属性】
技术研发人员：华进联，韩苗，李巴仑，李琛琛，赵献军，韩东瑶，景远翔，田宏凯，张翊华，白春娜，
申请(专利权)人：西北农林科技大学，
类型：发明
国别省市：