一种高产重组HRV-3C酶的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种高产重组HRV

【技术实现步骤摘要】
一种高产重组HRV
‑
3C酶的制备方法


[0001]本专利技术涉及分子生物学
，具体而言，涉及一种高产重组HRV
‑
3C酶的制备方法。

技术介绍

[0002]HRV
‑
3C酶是一种高效的蛋白酶，是一种半胱氨酸蛋白酶，其识别的剪切蛋白序列为Leu
‑
Glu
‑
Val
‑
Leu
‑
Phe
‑
Gln/Gly
‑
Pro，切割位点位于Gln
‑
Gly之间。商业化的3C蛋白酶是与GST融合的(GST
‑
3C)，称之为PreScission Protease，常用的pGEX系列融合表达载体中含有PreScission酶切位点。HRV
‑
3C酶在低温和高盐条件下，依然具有较高的酶切活性。与现有技术中其它蛋白酶相比，HRV
‑
3C酶具有特异性强，酶活性高等特点，在较低温条件下依然有较高的酶活，具有较高的商业价值。但是重组蛋白表达技术用于研究基因调控以及蛋白结构和功能，重组蛋白表达应用也具有较大的区别，从体内功能研究到大规模生产，用于生物治疗药物的发现和结果研究，为了消除纯化标签对目的蛋白的生理活性、物理结构和免疫原性的影响，所纯化的融合蛋白需要除去纯化标签。切割融合标签方法包括化学方法和酶学的方法。化学方法切割的条件比较剧烈，容易造成蛋白变性和蛋白侧链的化学修饰而所切割；切割的位点也只限定于一个或两个特定的氨基酸，容易造成对目的蛋白内部进行切割。而且蛋白酶的酶切特异高，有多种蛋白酶可供选择，在制备过程成也会存在产量低的问题。

技术实现思路

[0003]基于此，为了现有技术中HRV
‑
3C酶产量低的问题，本专利技术提供了一种高产重组HRV
‑
3C酶的制备方法，具体技术方案如下：
[0004]一种高产重组HRV
‑
3C酶的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
[0005]His
‑
Leaderseq
‑
HRV
‑
3C载体构建及转化；
[0006]菌种活化处理，得到活化菌液；
[0007]将所述活化菌液进行诱导表达后，然后通过提前预冷的离心机中进行菌体收集，于液氮速冻保存在
‑
80℃条件下，备用；
[0008]将速冻保存的菌体进行裂解处理，纯化处理，超滤浓缩处理，得到重组HRV
‑
3C酶；
[0009]其中，所述裂解处理的方法包括以下步骤：
[0010]根据菌体的质量配置裂解液，然后根据裂解液配置溶解酶溶液，置于冰上备用；
[0011]将菌体与所述裂解液混合的重悬菌体沿边缘吹打且观察未产生气泡，未出现重悬的细菌团块，后加入所述溶解酶溶液，置于冰面上20min～25min，期间需要摇晃和吹打使得混合液变粘稠，然后置于液氮环境、37℃的水浴中反复冻融若干次，再加入浓度为2mM的MgCl2和浓度为25U/mL的NovoBenzonase Nuclease，置于冰水中放置20min～25min，期间需要继续摇晃和吹打，观察到混合液呈现水状态，进行离心处理，收集上清液。
[0012]进一步地，在HRV
‑
3C的氨基端插入了6个组氨酸和来源于蜘蛛丝蛋白的部分序列
实现融合表达，见seq ID
‑
1。
[0013]进一步地，所述菌种活化处理的方法为：将转化了His
‑
Leaderseq
‑
HRV3C载体的BL21(DE3)甘油菌(后续简称为甘油菌)接种到LB液体培养基中，摇床过夜培养，且摇床的温度为37℃，转速为220rpm～250rpm，得到甘油菌活化液。
[0014]进一步地，所述诱导表达的方法为：
[0015]将甘油菌活化液接种至3mL的LB中，于37℃、220rpm的条件下培养5h～7h，然后接种至TB培养基中，于37℃、220rpm的条件下培养1h～4h，再将摇床温度调到18℃，后放置4℃的条件下，期间需要进行摇晃，待摇床温度在18℃时，再次放置于摇床，待摇床温度再次降到18℃时，诱导前取样，加IPTG开始诱导，得到诱导后菌液。
[0016]进一步地，所述菌体收集的方法为：
[0017]将诱导后菌液于8000rpm、4℃的条件下离心处理2min，离心后弃上清液，得到菌体。
[0018]进一步地，所述纯化处理的方法为：
[0019]将裂解处理收集的上清液0.45μm PES滤膜过滤，过滤后的上清液继进行若干次洗脱。
[0020]进一步地，所述若干次洗脱至少包括第一次洗脱、第二次洗脱以及第三次洗脱，且所述第一次洗脱为将上清液加入至His
‑
NTA柱子上，收集流穿液，然后使用6个柱体积的Wash Buffer洗去杂蛋白，收集第6个柱体积的流出液，再使用5个柱体积的Elution Buffer洗脱蛋白，收集洗脱液。
[0021]进一步地，所述第二次洗脱在所述第一次洗脱的基础上，取上清液体以同样的方法进行洗脱处理，所述第三次洗脱在第二次洗脱的基础上，取上清液体以同样的方法进行洗脱处理。
[0022]进一步地，所述超滤浓缩采用0.22μm PES滤膜过滤。
[0023]进一步地，所述超滤浓缩的方法为：
[0024]用灭菌水清洗超滤管，然后加入灭菌水，膜朝上离心，以3000g、5min、4℃的条件离心捡漏，待滤掉1/3的灭菌水即可；
[0025]加入3mL 2
×
Storage Buffer覆盖全部膜表面，以3000g、5min、4℃的条件离心润洗；
[0026]将纯化后的洗脱液放置离心管中，用2
×
Storage Buffer进行边摇缓慢稀释至10倍，观察蛋白有无发生沉淀；
[0027]将稀释后的液体放置滤芯中，以3000g、10～12min、4℃的条件离心，吹打均匀后，补加稀释后的液体至原体积，以3000g、10～12min、4℃的条件离心，离心后用枪轻轻吹打均匀，补入2
×
Storage Buffer至12mL将原Buffer稀释50倍以上，继续以3000g、10～12min、4℃的条件离心，以此重复若干次，待剩余2mL，用200μL枪头，轻吹膜，沿着缝隙边缘(没有膜的角落)将样品吸出，再加入200μL 2
×
Storage buffer，吹打润洗后吸出加到收集管中，得到重组HRV
‑
3C酶。
[0028]上述方案中制备的重组HRV
‑
3C酶不仅产量高，较GST
‑
3C酶相比，其产量是GST
‑
3C酶的2.3倍，经过多次纯化以及过滤后，还具有较高的纯度，且重组HRV本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种高产重组HRV
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3C酶的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：His
‑
Leaderseq
‑
HRV
‑
3C载体构建及转化；菌种活化处理，得到活化菌液；将所述活化菌液进行诱导表达后，然后通过提前预冷的离心机中进行菌体收集，于液氮速冻保存在
‑
80℃条件下，备用；将速冻保存的菌体进行裂解处理，纯化处理，超滤浓缩处理，得到重组HRV
‑
3C酶；其中，所述裂解处理的方法包括以下步骤：根据菌体的质量配置裂解液，然后根据裂解液配置溶解酶溶液，置于冰上备用；将菌体与所述裂解液混合的重悬菌体沿边缘吹打且观察未产生气泡，未出现重悬的细菌团块，后加入所述溶解酶溶液，置于冰面上20min～25min，期间需要摇晃和吹打使得混合液变粘稠，然后置于液氮环境、37℃的水浴中反复冻融若干次，再加入浓度为2mM的MgCl2和浓度为25U/mL的NovoBenzonase Nuclease，置于冰水中放置20min～25min，期间需要继续摇晃和吹打，观察到混合液呈现水状态，进行离心处理，收集上清液。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在HRV
‑
3C的氨基端插入了6个组氨酸和来源于蜘蛛丝蛋白的部分序列实现融合表达，见序列表。3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述菌种活化处理的方法为：将转化了His
‑
Leaderseq
‑
HRV3C载体的BL21甘油菌接种到LB液体培养基中，摇床过夜培养，且摇床的温度为37℃，转速为220rpm～250rpm，得到甘油菌活化液。4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述诱导表达的方法为：将甘油菌活化液接种至3mL的LB中，于37℃、220rpm的条件下培养5h～7h，然后接种至TB培养基中，于37℃、220rpm的条件下培养1h～4h，再将摇床温度调到18℃，后放置4℃的条件下，期间需要进行摇晃，待摇床温度在18℃时，再次放置于摇床，待摇床温度再次降到18℃时，诱导前取样，加IPTG开始诱导，得到诱导后菌液。5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：张旭，董露，芦盘金，盖作启，
申请(专利权)人：佛山科学技术学院，
类型：发明
国别省市：