裂解酶LysPd465在制备用于裂解革兰氏阳性菌或/和革兰氏阴性菌的药物中的应用制造技术

本发明专利技术提供了一种裂解酶LysPd465在制备用于裂解革兰氏阳性菌或/和革兰氏阴性菌的药物中的应用，所述裂解酶LysPd465氨基酸序列如SEQ ID NO.1，基因序列如SEQ ID NO.2所示。该裂解酶在体外对牙周炎疾病相关致病菌，如牙周炎相关的牙龈卟啉单胞菌、具核梭杆菌、中间普氏菌和伴放线放线聚集杆菌等具有较好的裂解效果，同时对粪肠球菌、变形链球菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、鼠伤寒沙门氏菌、肺炎克雷伯菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌具有良好的裂解效果，能够超广谱杀死革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。所述裂解酶能在大肠杆菌中进行可溶性表达，酶的产量高，在抗感染类药物的研发中具有较好的应用前景。较好的应用前景。较好的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
裂解酶LysPd465在制备用于裂解革兰氏阳性菌或/和革兰氏阴性菌的药物中的应用


[0001]本专利技术涉及生物工程
，特别涉及一种裂解酶LysPd465在制备用于裂解革兰氏阳性菌或/和革兰氏阴性菌的药物中的应用。

技术介绍

[0002]牙周炎是由牙菌斑生物膜以及宿主介导的炎症，导致牙周附着丧失。基于培养和分子检测的研究表明，牙周细菌病原体与牙周病的临床参数显着相关，例如牙龈发红、探诊出血和牙周破坏。在牙周病的情况下，生物膜的复杂性和对化学试剂的抵抗力需要机械治疗和辅助抗菌治疗，其中包括(龈上和龈下)非手术切除和手术矫正破坏组织(通常包括再生技术和材料)。辅助抗菌治疗基于局部应用，例如用于漱口水或洁牙剂的抗菌剂(洗必泰、聚维酮碘、精油或过氧化氢)以及抗生素治疗，后者已广泛用于晚期组织破坏的复杂病例。但抗生素的渗透可被生物膜抵抗，而全身性用药可能导致多重耐药细菌的发展以及机会性真菌感染。随着口腔病原体中抗生素耐药性的出现和发展，迫切需要开发新的抗菌策略来帮助控制和治疗牙周炎。
[0003]噬菌体是一类以细菌宿主的病毒，被认为是天然细菌捕食者，在其裂解周期结束时导致细菌细胞死亡。裂解酶是由噬菌体在裂解周期结束时编码的肽聚糖水解酶，帮助它们水解细菌的肽聚糖，这使它们能够将后代噬菌体释放到细菌外。由于裂解酶对其宿主细菌耐药可能性低、安全水平高和易于设计的独特优势，裂解酶被视为抗生素的有效替代品。已有革兰氏阴性菌裂解酶在动物感染模型中被证实安全有效，而部分革兰氏阳性菌裂解酶已成功应用于商业销售或进入到临床试验阶段。
[0004]牙周炎是常见的慢性口腔健康问题，对全球健康经济造成严重负担。尚无牙周炎病原体相关的革兰氏阴性菌噬菌体裂解酶发现。因此，有必要开发新的、针对牙周炎革兰氏阴性菌均具有高效裂解活性的噬菌体裂解酶。

技术实现思路

[0005]本专利技术目的是提供一种裂解酶LysPd465在制备用于裂解革兰氏阳性菌或/和革兰氏阴性菌的药物中的应用，该裂解酶LysPd465在体外对牙龈卟啉单胞菌，具核梭杆菌，中间普氏菌、伴放线放线聚集杆菌，粪肠球菌、变形链球菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、鼠伤寒沙门氏菌、肺炎克雷伯菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌具有较好的裂解效果，能广谱裂解革兰氏阴性菌和阳性菌。
[0006]为了解决上述技术问题，本专利技术采用如下技术方案：
[0007]在本专利技术的第一方面，提供了一种裂解酶LysPd465的核酸分子，所述核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
[0008]在本专利技术的第二方面，提供了一种裂解酶LysPd465表达载体，所述表达载体包含有编码所述核酸分子。
[0009]进一步地，所述表达载体包括原核表达载体和病毒载体中的一种。
[0010]在本专利技术的第三方面，提供了一种裂解酶LysPd465表达载体的制备方法，所述方法包括：
[0011]获得如SEQ ID NO：2所示的裂解酶LysPd465的核酸分子的目的基因片段；
[0012]将所述目的基因片段和pET28b表达载体经过NcoI和XhoI双酶切，后酶连，获得表达载体pET28b
‑
LysPd465。
[0013]在本专利技术的第四方面，提供了一种包含所述表达载体的重组菌或工程化细胞系。
[0014]在本专利技术的第五方面，提供了一种所述的裂解酶LysPd465或所述的核酸分子或所述表达载体或所述的重组菌或工程化细胞系在制备用于裂解革兰氏阳性菌或/和革兰氏阴性菌的药物中的应用。
[0015]在本专利技术的第六方面，提供了一种裂解革兰氏阳性菌或/和革兰氏阴性菌的药物，所述药物包括所述的裂解酶LysPd465或所述的表达所述裂解酶LysPd465的重组表达载体或所述的包含所述裂解酶LysPd465的表达载体的重组菌或工程化细胞系。
[0016]在本专利技术的第七方面，提供了一种采用裂解酶LysPd465裂解含粪肠球菌ATCC 51299的待测样品的方法，所述方法包括：
[0017]将粪肠球菌ATCC 51299培养至对数期或稳定期，低温离心收集沉淀后，用HEPES缓冲液洗涤一次后，然后将洗涤后的沉淀重悬于pH为7～9的缓冲液中，得到粪肠球菌ATCC 51299菌液；
[0018]取裂解酶LysPd465与上述菌液混合，使得裂解酶LysPd465的终浓度至25～100μg/ml，于4～40℃下孵育15～60min，获得粪肠球菌ATCC 51299被裂解后的样品。
[0019]进一步地，所述缓冲液包括乙酸钠缓冲液、Tris缓冲液和甘氨酸
‑
NaOH缓冲液中的至少一种。
[0020]本专利技术实施例中的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：
[0021]本专利技术提供的一种裂解酶LysPd465在制备用于裂解革兰氏阳性菌或/和革兰氏阴性菌的药物中的应用，本专利技术筛选出一种裂解酶LysPd465，经实验验证，这个裂解酶在体外对牙周炎疾病相关致病菌，如牙周炎相关的牙龈卟啉单胞菌、具核梭杆菌、中间普氏菌和伴放线放线聚集杆菌等具有较好的裂解效果，同时对粪肠球菌、变形链球菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、鼠伤寒沙门氏菌、肺炎克雷伯菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌具有良好的裂解效果，能够超广谱杀死革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。同时，所述裂解酶能在大肠杆菌中进行可溶性表达，酶的产量高(20mg/L，每1L大肠杆菌可获得20mg蛋白)，因此，所述牙周菌系列裂解酶在抗感染类药物的研发中具有较好的应用前景。
附图说明
[0022]为了更清楚地说明本专利技术实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
[0023]图1为本专利技术实施例1中裂解酶LysPd465纯化后的SDS
‑
PAGE胶图；
[0024]图2为本专利技术实施例3中裂解酶LysPd465裂解粪肠球菌ATCC 51299的时间变化结
secretion via the general secretory pathway in Streptococcus mutans)；
[0042]所述鲍曼不动杆菌为WHG40137鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)，为中国科学院武汉病毒研究所保存菌株(该菌株见文献Intrinsic Antimicrobial Peptide Facilitates a New Broad
‑
Spectrum Lysin LysP53 to Kill Acinetobacter baumannii In Vitro and in a Mouse Burn Infection Model)；
[0043]所述铜绿假单胞菌为WHG50015铜绿假单胞菌(Pseudomonas aerugi本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种编码裂解酶LysPd465的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。2.一种裂解酶LysPd465表达载体，其特征在于，所述表达载体包含有编码权利要求1所述的核酸分子。3.根据权利要求2所述的一种裂解酶LysPd465表达载体，其特征在于，所述表达载体包括原核表达载体和病毒载体中的一种。4.一种裂解酶LysPd465表达载体的制备方法，其特征在于，所述方法包括：获得如SEQ ID NO：2所示的裂解酶LysPd465的核酸分子的目的基因片段；将所述目的基因片段和pET28b表达载体均经过NcoI和XhoI双酶切，后酶连，获得表达载体pET28b
‑
LysPd465。5.一种包含权利要求2
‑
3任一项所述的表达载体的重组菌或工程化细胞系。6.一种权利要求1所述的核酸分子或权利要求2
‑
3任一所述表达载体或权利要求4制备得到的表达载体或权利要求5所述的重组菌或工程化细胞系在制备用于裂解革兰氏阳性菌或/和革兰氏阴性菌的药物中的应用。7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述革兰氏阴性菌包括牙龈卟啉单胞菌、具核梭杆菌、中间普氏...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄声富，姚芳芳，杨航，危宏平，何佳骏，李宇红，
申请(专利权)人：武汉大学，
类型：发明
国别省市：