一种尿路致病性大肠埃希菌重组蛋白组合物LS、其构建、表达、纯化方法及其应用技术

一种尿路致病性大肠埃希菌重组蛋白组合物LS、其构建、表达、纯化方法及其应用，属于基因工程技术领域。本发明专利技术将LpcA和SurA基因进行PCR扩增并分别插入到克隆载体的多克隆位点中,构建重组载体；然后将重组载体转化入大肠杆菌表达蛋白；最后进行纯化得到LpcA蛋白和SurA蛋白的组合物LS，该组合物LS可在尿路感染疫苗中应用。本发明专利技术的优点在于：该蛋白疫苗可诱导动物较强的细胞和体液免疫反应；通过动物攻毒实验表明，其具有降低膀胱和肾脏细菌载量的保护效果。的保护效果。的保护效果。

【技术实现步骤摘要】
一种尿路致病性大肠埃希菌重组蛋白组合物LS、其构建、表达、纯化方法及其应用


[0001]本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种尿路致病性大肠埃希菌重组蛋白组合物LS、其构建、表达、纯化方法及其应用。

技术介绍

[0002]尿路感染是严重威胁人类健康的第二大感染性疾病，尿路致病性大肠埃希菌是其主要致病菌。据报道，60％的女性和12％的男性一生中至少有一次尿路感染的经历,20％
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30％的女性患者在首次尿路感染后的3～4个月内继发二次感染；部分患者会继发多次感染，甚至终生伴随感染。绝经后女性，孕妇、儿童及免疫功能障碍者等更是尿路感染的易感人群，此外置留导尿管和泌尿道疾病解剖结构异常等因素也会增加尿路感染的发生。尿路感染严重影响患者生活质量，甚至可引起尿源性脓毒症危及生命。如何预防及减少尿路感染复发是目前该领域研究的难点之一。
[0003]临床抗生素治疗虽可缓解急性尿路感染，但对复发尿路感染的预防和治疗作用有限。此外，抗生素的过度应用不但容易使细菌产生耐药性导致治疗失败，而且会诱发难治性尿路感染的发生。尿路感染疫苗可通过激发机体的抗原特异性免疫应答，发挥预防和治疗感染的双重作用，是近些年预防和治疗复发尿路感染的研究热点。根据疫苗组分和制备方法的不同，尿路感染疫苗主要有全细胞/裂解物疫苗、减毒活疫苗和亚单位疫苗三种类型。其中，全细胞/裂解物疫苗已在欧洲上市，该类型疫苗虽然给临床治疗和预防复发尿路感染带来了新的手段，但是需要长时间连续接种才能产生理想的效果；减毒活疫苗所诱导的保护性免疫应答持续时间有限，因此针对该类型的疫苗研究较少。蛋白亚单位疫苗是将细菌保护性蛋白抗原和递送佐剂相结合而构建的一种新型疫苗类型，该类型疫苗由于成分明确、安全性高、诱导较强的免疫记忆反应从而提供较长的保护效应等优点，成为尿路感染疫苗的研究热点。
[0004]SurA是一种细小蛋白样肽酰脯氨酰异构酶(parvulin
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like peptidyl
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prolyl isomerase，PPIase)，在大肠埃希菌周质(细菌内膜与外模之间的空隙)中具有分子伴侣的作用，参与外膜蛋白的组装、转运及折叠。LpcA(也称为GmhA)是一种存在于细胞质的磷酸庚糖异构酶，参与合成脂多糖(LPS)前体甘油三酯的核心成分。前期研究发现，在尿路致病性大肠埃希菌敲除LpcA和SurA的编码基因后，细菌的在小鼠体内的生存和持续感染能力明显下降。因此，我们推测这两个蛋白可作为尿路致病性大肠埃希菌所致尿路感染药物治疗和疫苗研究的候选靶点。但是，如何应用基因工程的方法获得这两个蛋白，并验证他们在尿路疫苗中的应用，是仍待解决的技术问题。

技术实现思路

[0005]针对现有技术存在的问题，本专利技术的目的在于设计提供一种尿路致病性大肠埃希菌重组蛋白组合物LS、其构建、表达、纯化方法及其应用的技术方案。
[0006]本专利技术具体采用以下技术方案实现：
[0007]本专利技术第一方面提供了一种尿路致病性大肠埃希菌重组蛋白组合物LS，该重组蛋白组合物LS含有重组蛋白LpcA和重组蛋白SurA，所述重组蛋白LpcA的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述重组蛋白SurA的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
[0008]进一步，所述重组蛋白LpcA和重组蛋白SurA的质量比为1:1。
[0009]本专利技术第二方面提供了上述一种尿路致病性大肠埃希菌重组蛋白组合物LS在制备治疗尿路致病性大肠埃希菌所致尿路感染的药物中的应用。
[0010]本专利技术第三方面提供了上述一种尿路致病性大肠埃希菌重组蛋白组合物LS在制备治疗尿路致病性大肠埃希菌所致尿路感染的疫苗中的应用。
[0011]本专利技术第四方面提供了一种尿路致病性大肠埃希菌重组蛋白组合物LS的构建、表达和纯化方法，其包括以下步骤：
[0012]1)将LpcA和SurA基因进行PCR扩增并分别插入到克隆载体pET30a(+)的多克隆位点中，构建重组载体pET30a(+)
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LpcA和pET30a(+)
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SurA；
[0013]2)将重组载体转化入大肠杆菌得到表达融合蛋白LpcA和SurA的菌种，利用该菌种表达重组蛋白LpcA和SurA；
[0014]3)纯化重组蛋白LpcA和SurA。
[0015]进一步，所述步骤1)具体包括：
[0016](1)根据GenBank中大肠埃希菌E.coli str.K12中LpcA GeneID 949134，579bp和SurAGeneID 944812，1287bp的基因序列和所克隆载体的酶切位点序列，分别设计含核酸内切酶的上下游引物：surA F和surA R；LpcA F和LpcA R，所述surA F的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，surA R的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，LpcA F的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，LpcA R的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；
[0017](2)提取尿路致病性大肠埃希菌UTI89菌株的DNA做为模板，用步骤(1)中的引物，PCR扩增LpcA和surA基因序列；PCR产物经胶回收纯化后备用，得到LpcA PCR扩增产物和surA PCR扩增产物；
[0018](3)提取pET30a(+)质粒：扩增含有pET30a(+)质粒的大肠埃希菌菌种至5mL，并应用质粒提取试剂盒提取pET30a(+)；
[0019](4)用EcorⅠ和Hind
ꢀⅢ
核酸内切酶，分别酶切步骤(2)中的LpcA PCR扩增产物、surAPCR扩增产物和步骤(3)中提取的pET30a(+)质粒；酶切后的LpcA PCR扩增产物、surAPCR扩增产物和pET30a(+)质粒，分别经PCR产物纯化和胶回收纯化；纯化后的LpcA基因和pET30a(+)质粒，surA基因和pET30a(+)质粒，在T4连接酶的作用下进行连接；连接产物转化入E.coli DH5α中，经在抗生素平板克隆筛选，挑取阳性克隆、提取质粒，进行测序鉴定，得到重组载体pET30a(+)
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LpcA和pET30a(+)
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SurA。
[0020]进一步，所述步骤2)具体包括：
[0021](a)将构建成功的pET30a(+)
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LpcA和pET30a(+)
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SurA质粒载体分别转化入表达菌株大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中，得到重组蛋白保存菌种；
[0022](b)取步骤(a)中保存的菌种依次进行活化、震荡扩增培养、诱导振荡培养和离心，得到重组蛋白保存菌种的菌体；
[0023](c)将步骤(b)中获取的菌体重悬于PB缓冲液中，冰浴下超声破碎，离心，分别收集
上清和沉淀，将上清和沉淀分别进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，分析蛋白表达情况。
[0024]进一步，所述步骤3)具体包本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种尿路致病性大肠埃希菌重组蛋白组合物LS，其特征在于含有重组蛋白LpcA和重组蛋白SurA，所述重组蛋白LpcA的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述重组蛋白SurA的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。2.如权利要求1所述的一种尿路致病性大肠埃希菌重组蛋白组合物LS，其特征在于所述重组蛋白LpcA和重组蛋白SurA的质量比为1:1。3.如权利要求1或2所述的一种尿路致病性大肠埃希菌重组蛋白组合物LS在制备治疗尿路致病性大肠埃希菌所致尿路感染的药物中的应用。4.如权利要求1或2所述的一种尿路致病性大肠埃希菌重组蛋白组合物LS在制备治疗尿路致病性大肠埃希菌所致尿路感染的疫苗中的应用。5.如权利要求1所述的一种尿路致病性大肠埃希菌重组蛋白组合物LS的构建、表达和纯化方法，其特征在于包括以下步骤：1)将LpcA和SurA基因进行PCR扩增并分别插入到克隆载体pET30a(+)的多克隆位点中，构建重组载体pET30a(+)
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LpcA和pET30a(+)
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SurA；2)将重组载体转化入大肠杆菌得到表达融合蛋白LpcA和SurA的菌种，利用该菌种表达重组蛋白LpcA和SurA；3)纯化重组蛋白LpcA和SurA。6.如权利要求5所述的方法，其特征在于所述步骤1)具体包括：(1)根据GenBank中大肠埃希菌E.colistr.K12中LpcA GeneID 949134，579bp和SurAGeneID 944812，1287bp的基因序列和所克隆载体的酶切位点序列，分别设计含核酸内切酶的上下游引物：surA F和surA R；LpcA F和LpcA R，所述surA F的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，surA R的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，LpcA F的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，LpcA R的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；(2)提取尿路致病性大肠埃希菌UTI89菌株的DNA做为模板，用步骤(1)中的引物，PCR扩增LpcA和surA基因序列；PCR产物经胶回收纯化后备用，得到LpcA PCR扩增产物和surA PCR扩增产物；(3)提取pET30a(+)质粒：扩增含有pET30a(+)质粒的大肠埃希菌菌种至5mL，并应用质粒提取试剂盒提取pET30a(+)；(4)用EcorⅠ和Hind
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【专利技术属性】
技术研发人员：牛红霞，胡权洁，杜蕴洁，朱爱松，于成，周帅，
申请(专利权)人：浙江中医药大学，
类型：发明
国别省市：