鱼类哈维氏弧菌ＰＣＲ快速检测试剂盒及使用方法技术

本发明专利技术公开一种鱼类哈维氏弧菌ＰＣＲ快速检测试剂盒及使用方法。该试剂盒包括７种试剂：裂解液、ＰＣＲ反应液、ｄＮＴＰ混合物、Ｔａｑ酶液、引物对、阳性对照及阴性对照等。哈维氏弧菌ＤＮＡ的特异引物对：５’－ＧＡＡＡＡＣＣＡＡＴＡＣＡＴＣＧＣＴＣＴＧＡＣＴ－３’和５’－ＴＴＧＡＣＡＡＴＴＧＡＴＴＣＧＴＡＣＴＴＴＣＴＡＧＣ－３’。本发明专利技术的突出优点是仅需一对哈维氏弧菌ＤＮＡ的特异引物，即可对不同样品中哈维氏弧菌进行检测或监控，方法简便、快速、灵敏、应用范围广。不但能对养殖鱼类疾病进行快速诊断，而且可为海水水质监控以及海产品质量控制提供最简便方法。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于水产动物、海产品及海水污染的监测技术。特别是水产养殖动物的哈维氏弧菌感染的检测一鱼类哈维氏弧菌PCR快速检测试剂盒及使用方法。
技术介绍
哈维氏弧菌广泛存在于海洋环境中，是引起水产动物感染致病的主要菌源，能引 起水产动物的皮肤溃烂、肌体出血和大批死亡，危害十分巨大。已有的研究表明，哈维氏弧 菌携带的溶血素是水产动物的致病因子即感染致病的根源，对于哈维氏弧菌的检测方法， 目前主要有生理生化检测方法、荧光抗体技术、酶联免疫吸附试验、rRNA基因探针杂交技术 等。但这些方法存在一些缺点和不足生理生化检测十分耗时耗力、结果不稳定；荧光抗体 技术需要较昂贵的仪器设备；酶联免疫吸附实验灵敏度不高，且易受干扰、rRNA基因在物 种中非常保守，使得技术特异性不强。目前的PCR虽然是一种具有灵敏度高、特异性强的靶 DNA快速检测方法，样品中含有少量的致病因子就能检出。然而，已有的PCR检测技术方法 较为繁琐，且对哈维氏弧菌检测识别率较低。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种鱼类哈维氏弧菌的PCR快速检测试剂盒及使用方法，以 快速检测和判定或者监测水产动物、海产品及哈维氏弧菌污染的海水，弥补现有技术的不足。研究表明哈维氏弧菌携带的溶血素是水产动物感染致病的根源，即本专利技术所指 的致病因子，快速检测样品中的致病因子基因即可判断水产动物是否感染致病，从而为进 一步为防治感染提供依据。本专利技术在克隆出哈维氏弧菌致病因子的编码基因，分析其序列 特征的基础上，以该特异基因的保守区段设计特异性引物，并且采用PCR快速技术检测哈 维氏弧菌，具有准确、快速、灵敏等优点。可作为水产养殖鱼类疾病的快速、简便、准确的检 测方法，也可用作养殖水体、饲料和海产品的质量检测以及海水污染的监控。本专利技术的主要原理为裂解液将样品中的细菌进行裂解，释放出细菌DNA，加入 PCR反应试剂和Tag酶等，以哈维氏弧菌致病因子的特异DNA片段引物为模板，对样品中释 放出的哈维氏弧菌致病因子DNA进行专一性扩增，浓度达到可检测范围后进行检测。由于 设计的特异引物为哈维氏弧菌所特有，因此，样品中含有的哈维氏弧菌就被会被检出。本专利技术的PCR快速检测试剂盒包括以下7种试剂(1)裂解液含有胰蛋白酶、Tris、EDTA，pH为7. 5-8. 5，其浓度分别为1-lOmg/mL， 10-50mmol/L,l-10mmol/L ；(2) PCR 反应液含 dNTP 和 MgCL2 溶液dATP, dTTP, dCTP和dGTP的四种混合物dNTP，其中每种浓度2. 0-3. Ommol/L ；浓度 为 20-30mmol/L 的 MgCL2 溶液；(3)Taq 酶液3υ/μ L ；(4)引物对所述的引物对是人工设计并人工合成的DNA片段，碱基序列分别为上游引物5，-GAAAACCAATACATCGCTCTGACT-3，，10-20μ mol/L下游引物5，-TTGACAATTGATTCGTACTTTCTAGC-3，，10-20μ mol/L (5)灭菌去离子水(6)阳性对照(7)阴性对照。本专利技术使用PCR快速检测试剂盒检测哈维氏弧菌的方法，其特征在于检测程序如 下a.待检样品的处理及模板DNA制备待检样品经无菌生理盐水清洗后，取0. 1-0. 2g待检组织于洁净的灭菌勻浆器中， 加入0. 5-1. OmLTE缓冲液，充分研磨，取0. 5-1. OmL样品液于1. 5mL灭菌离心管，用于提取 模板DNA。将上述模板DNA于100°C水浴保持10-15分钟。冷却后于4°C 12000rpm离心10 分钟，吸取上清200 μ L作为PCR模板，并于-20°c保存。海水样品不需要样品处理，可直接进入PCR扩增。b. PCR 扩增在一个PCR管内加入1 μ L模板DNA，9 μ LPCR反应液，1 μ L酶液，1 μ L引物，用灭 菌去离子水补足到50 μ L，在3000g离心5秒钟混勻，置于PCR仪中进行扩增使扩增倍数达 到IO7左右。同样制作其它待测样品以及阳性对照和阴性对照品。PCR扩增条件94°C预变性3分钟，94°C变性1分钟，58°C退火1分钟，72°C延伸1 分钟，如此进行25个循环，然后72°C延伸10分钟。本专利技术的PCR快速检测结果判定方法取10 μ L PCR产物(加2-6 μ L 0. 25-0. 75%澳酚蓝上样缓冲液)加于1. 2-2. 0% 琼脂糖凝胶中(含有溴化乙锭浓度为0. 5-1. 0 μ g/mL)，100-150V电压电泳25-30分钟，取 凝胶在紫外透射仪下观察。当在622bp出现特异核酸条带，即可判断样品中含有哈维氏弧 菌，反之则没有。同样方法可判断海产品及海水受污染情况。本专利技术在设计哈维氏弧菌致病因子特异引物并成功建立PCR检测技术的基础上， 进一步研制成简单快速敏感的PCR检测试剂盒，与现有的哈维氏弧菌病原检测技术相比， 本专利技术具有以下显著特点本专利技术的PCR快速检测试剂盒，仅需提供一对针对哈维氏弧菌 DNA的特异引物，即可对样品中哈维氏弧菌进行检测或监控，方法简便、快速、灵敏，而为水 产养殖、海水水质监控以及海产品加工的质量控制提供准确的、标准的、科学的方法。通过 快速检测样品中的致病因子基因即可判断水产动物是否感染致病，从而为进一步防治感染 提供依据。本专利技术具有的优点如下1.检测速度快1_3小时即可得到检测结果，而其它方法需要一天或一周以上；2.检测灵敏度较高检测下限为10个/yL致病菌，其它方法须经过细菌培养增 殖后才能进行检测；3.可以应用于多领域多种类样品的检测水产养殖领域水生动物遭受哈维氏弧菌感染情况的检测，养殖水体被污染情况的监测，养殖饲料和鲜活饵料遭受哈维氏弧菌污 染的品控。环保领域海水受污染情况的监控。食品领域水产品加工过程中时哈维氏弧菌污染的防控。具体实施例方式本专利技术的所述鱼类哈维氏弧菌PCR快速检测试剂盒，其中所述PCR试剂的最佳成 分和用量为 实施例11.养殖场病鱼及健康鱼中哈维氏弧菌的检测取工厂化海水养殖场发病的牙鲆、大菱鲆、鲈鱼及对照健康鱼，样品鱼用无菌生理 盐水清洗，无菌取病变部位组织或正常组织0. lg，加0. 5mL PH为8. 0、浓度为lOmmol/L的 裂解液，勻浆。然后置100°C水浴中保持10分钟。取出冷却后于4°C 12000rpm离心10分 钟，吸取上清1 μ L作为PCR模板，加入最终浓度为2mmol/L的dNTP、20mmol/L的MgCL2溶 液、20 μ mol/L的上下游引物、3U/μ L的Taq酶液以及相应体积的灭菌去离子水，进行PCR 扩增。取10 μ LPCR产物加于1. 5%琼脂糖凝胶中，IOOv电压电泳30分钟，在紫外透射仪 下观察。在622bp出现特异条带，此即为样品中含有哈维氏弧菌。健康鱼样品在622bp无 特异条带。实施例22.海水中哈维氏弧菌的检测取工厂化养殖的鱼池、虾池、扇贝育苗池中海水样品。用无菌海水对样品进行5倍 稀释，然后置100°c水浴中保持10分钟。取出冷却后于4°C 12000rpm离心10分钟，吸取上 清1 μ L作为PCR模板，加入最终浓度为2mmol/L的dNTP、20mmol/L的MgCL2溶液、20 μ mol/ L的上下游引物本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种鱼类哈维氏弧菌ＰＣＲ快速检测试剂盒，其特征在于包括以下７种试剂：（１）裂解液：含有胰蛋白酶、Ｔｒｉｓ、ＥＤＴＡ，ｐＨ为７．５－８．５，其浓度分别为１－１０ｍｇ／ｍＬ，１０－５０ｍｍｏｌ／Ｌ，１－１０ｍｍｏｌ／Ｌ；（２）ＰＣＲ反应液：含ｄＮＴＰ和ＭｇＣＬ↓［２］溶液；ｄＡＴＰ，ｄＴＴＰ，ｄＣＴＰ和ｄＧＴＰ的四种混合物ｄＮＴＰ，其中每种浓度２．０－３．０ｍｍｏｌ／Ｌ；浓度为２０－３０ｍｍｏｌ／Ｌ的ＭｇＣＬ↓［２］溶液；（３）Ｔａｑ酶液：３Ｕ／μＬ．；（４）引物对：上游引物：５’－ＧＡＡＡＡＣＣＡＡＴＡＣＡＴＣＧＣＴＣＴＧＡＣＴ－３’，１０－２０μｍｏｌ／Ｌ下游引物：５’－ＴＴＧＡＣＡＡＴＴＧＡＴＴＣＧＴＡＣＴＴＴＣＴＡＧＣ－３’，１０－２０μｍｏｌ／Ｌ（５）灭菌去离子水（６）阳性对照（７）阴性对照。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：陈吉祥，刘瑞，徐广峰，
申请(专利权)人：中国海洋大学，
类型：发明
国别省市：95[中国|青岛]