本发明专利技术公开了一种标记细胞骨架蛋白的多肽及其真核表达载体，该多肽转入细胞或者通过真核表达载体在细胞得到表达后能够与微丝结合，荧光标记的多肽能够用于细胞骨架蛋白的标记。所述的多肽为ＪＮ２７、ＪＮ３０或者ＴａｔＪＮ２７；所述的真核表达载体为ｐＥＧＦＰ－Ｃ２－ＪＮ２７或者ｐＥＧＦＰ－Ｃ２－ＪＮ３０。荧光标记的ＪＮ２７、ＪＮ３０、ＴａｔＪＮ２７多肽导入细胞，ｐＥＧＦＰ－Ｃ２－ＪＮ２７和ｐＥＧＦＰ－Ｃ２－ＪＮ３０真核表达质粒转染细胞后，均可以与细胞内骨架蛋白中的微丝蛋白结合，实现细胞内骨架蛋白的荧光标记。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，涉及细胞骨架蛋白的标记，特别涉及一种标记细胞骨 架蛋白的多肽及真核表达载体。
技术介绍
运动是生命体最显著的特征之一。作为生命体组成单位的细胞，其多种多样的生 理活动都与细胞的运动密切相关，比如细胞形态的改变与维持、细胞内物质运输、细胞分 裂、胞吞与胞吐等。而存在于细胞(特别是真核细胞)中的细胞骨架系统，不仅是支撑活细 胞的结构，决定细胞的形状，赋予其强度，而且是细胞内各种细胞器空间排列的物质基础。 细胞骨架包括三种类型的蛋白质纤维，即微丝(microfilament)、微管(Microtubule)和中 间纤维(intermediate filaments, IF)。微丝是由肌动蛋白(actin)组成的直径约为7nm的纤维结构。肌动蛋白又被称 为G-Actin，全称为球状肌动蛋白(Globular Actin)，简称G肌动蛋白。肌动蛋白单体为球 形，其表面上有一 ATP结合位点。肌动蛋白单体一个接一个连成一串肌动蛋白链，两串这 样的肌动蛋白链互相缠绕扭曲成一股微丝；这种肌动蛋白多聚体又被称为纤维形肌动蛋白 (F-Actin, Fibrous Actin)。微丝能被组装和去组装当单体上结合的是ATP时，就会有较 高的相互亲和力，单体趋向于聚合成多聚体，就是组装；而当ATP水解成ADP后，单体亲和力 就会下降，多聚体趋向解聚，于是去组装。细胞内肌动蛋白的这种组装_去组装动态变化参与了细胞许多重要的生理过程， 比如细胞运动时伪足的生成、发育时期干细胞的迁移、神经元细胞生长锥的生长、细胞与细 胞外基质的相互作用以及肿瘤细胞的转移等。鬼笔环肽(phalloidin)是从毒蕈类鬼笔鹅膏(Amanita phalloides)中得到的有 毒的环状七肽，它同细胞松弛素B的作用相反，只与聚合的微丝(F-Actin)结合，而不与肌 动蛋白单体分子结合。它同聚合的微丝结合后，抑制了微丝的解体，因而破坏了微丝的聚合 和解聚的动态平衡。鬼笔环肽可以与聚合的微丝结合的特殊性质使得它具有一个重要的用途通过让 这种毒素与荧光物质结合，然后FITC和Rhodamin等荧光物质标记的鬼笔环肽再特异的与 真核细胞的F-actin结合，从而显示微丝骨架在细胞中的分布，研究细胞内部的工作机制。 生产这种荧光标记的鬼笔环肽的公司包括Invitrogen和Sigma公司，但是售价不菲。
技术实现思路
本专利技术解决的问题在于提供一种相对廉价的、实时的标记细胞骨架蛋白F-actin 的多肽及真核表达载体，该多肽转入细胞或者通过真核表达载体在细胞得到表达后可以与 微丝结合，结合荧光标记的多肽能够用于细胞骨架蛋白的标记。本专利技术是通过以下技术方案来实现一种标记细胞骨架蛋白的多肽，该多肽为JN27，其氨基酸序列如SEQ. ID. NO. 1所不。所述的多肽是在JN27的C端增加3个氨基酸残基得到的多肽JN30，其氨基酸序列 如 SEQ. ID. NO. 2 所示。所述的多肽是在JN27的N端增加11个氨基酸残基的穿膜肽得到的多肽TatJN27， 其氨基酸序列如SEQ. ID. NO. 3所示。一种用于细胞骨架蛋白标记的真核表达载体，该载体包含标记基因EGFP和细胞 骨架蛋白靶向基因的融合基因，所述的细胞骨架蛋白靶向基因为基因JN27或JN30;基因 JN27的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 4所示，基因JN30的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 5所示。所述的真核表达载体是pEGFP-C2-JN27，通过HindIII和BamHI酶切位点将基因 JN27克隆到pEGFP-C2载体上。所述的真核表达载体是pEGFP-C2-JN30，通过HindIII和BamHI酶切位点将基因 JN30克隆到pEGFP-C2载体上。多肽JN27、JN30或TatJN27应用于细胞骨架蛋白的标记。所述的应用于细胞骨架蛋白的标记是将多肽JN27或JN30用荧光物质标记后，再 将荧光标记的JN27或JN30加入到抗体封闭液中，与经过固定、Triton处理的待标记细胞 孵育2h，然后在荧光显微镜下显示标记结果；或者将多肽TatJN27用荧光物质标记后，再将荧光标记的TatJN27直接加入待标 记细胞的培养液中，37°C孵育12h ；然后在荧光显微镜下显示标记结果。真核表达载体PEGFP-C2-JN27或pEGFP_C2-JN30应用于细胞骨架蛋白的标记。所述的应用于细胞骨架蛋白的标记是将真核表达载体pEGFP-C2-JN27或 PEGFP-C2-JN30转染到待标记的细胞中，使其得到表达后，然后在荧光显微镜下显示标记结合ο与现有技术相比，本专利技术具有以下有益的技术效果1、本专利技术提供能够与微丝(F-actin)结合的多肽，该多肽能够应用于细胞骨架蛋 白的标记，以代替价格昂贵的鬼笔环肽；所述的多肽包括JN27、JN30和TatJN27 ；对于细胞骨架蛋白的标记包括人工合成的带有荧光标记的JN27或JN30多肽导入 固定的待标记细胞的静态指示，和将人工合成的带有荧光标记的TatJN27加入待标记的细 胞培养液中的动态指示。2、本专利技术提供的细胞骨架蛋白标记的多肽，其中多肽JN27和JN30是大鼠 Juxtanodin基因表达的JN分子C末端的27肽和30肽，这是在JN全长分子与微丝结合的 基础上，通过对JN及其同源分子的序列分析，确定结合微丝的关键位点；多肽TatJN27是在JN27的基础上的进行修饰在JN27的N端连接Tat序列中的 11个氨基酸残基，使得修饰后的多肽能够在穿膜肽的引导下进入待标记的细胞中；本专利技术以鬼笔环肽作为对照，证实了上述三个多肽能够与微丝结合，荧光结果显 示其所标记的细胞骨架蛋白与鬼笔环肽共定位。3、为了实现对细胞骨架蛋白的荧光标记，需要在与微丝结合的靶向分子上结合荧 光物质，以便在荧光显微镜下显示；现有的荧光标记的鬼笔环肽是通过化学的方法实现荧光物质与鬼笔环肽的标记；而本专利技术提供的JN27、JN30和TatJN27多肽，可以通过在体外采用固相合成法合成纯 度大于95%的多肽，然后用化学法对合成的多肽进行荧光物质的标记，起到对细胞内的微 丝具有靶向荧光指示作用；所述的荧光物质为荧光素花青素3 (Cy3)或者异硫氰酸荧光素 (FITC)；与鬼笔环肽从毒蕈类鬼笔鹅膏提取相比，本专利技术采用固相合成法合成靶向的多 肽，成本明显降低。4、与鬼笔环肽标记固定细胞的细胞骨架蛋白相比，本专利技术提供的具有穿膜功能的 TatJN27多肽，直接加入到待标记细胞的培养液中就可以对细胞骨架蛋白进行标记，实现活 细胞的细胞骨架蛋白的标记；进而实现对细胞活动中的细胞骨架进行连续的观察。5、在提出具有微丝的靶向多肽的基础上，本专利技术提供更进一步的细胞骨架的动态 标记方案构建绿色荧光蛋白与JN27多肽或JN30多肽的融合表达载体真核表达载体 PEGFP-C2-JN27或pEGFP_C2-JN30，这样实际相当于将靶向多肽与绿色荧光蛋白进行了融 合表达；将真核表达载体pEGFP-C2-JN27或pEGFP_C2-JN30转染待标记的细胞，并使其得 到表达，该真核表达载体表达后得到的融合蛋白本身就是荧光标记的靶向多肽；其靶向是 指向微丝的，这样在荧光显微镜下就可以清楚的本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种标记细胞骨架蛋白的多肽，其特征在于：该多肽为ＪＮ２７，其氨基酸序列如ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张斌，王涛，药立波，
申请(专利权)人：中国人民解放军第四军医大学，
类型：发明
国别省市：87[中国|西安]
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