具有轴向选择性激发的荧光三维纳米分辨成像方法及装置制造方法及图纸

本发明专利技术适用于细胞等样品三维成像，提供了一种具有轴向选择性激发的荧光三维纳米分辨成像方法及装置。所述方法包括以下步骤：产生激发光和熄灭光；分光，将所述激发光分成第一激发光和第二激发光，将所述熄灭光分成第一熄灭光和第二熄灭光；调整所述第一激发光与第二激发光之间的相位差和强度比，调整所述第一熄灭光与第二熄灭光之间的相位差和强度比，使所述第一激发光与第二激发光和所述第一熄灭光与第二熄灭光在样品轴向的一个薄层或几个薄层处相干形成轴向调制照明实现轴向选择性激发。所述轴向选择性激发使大部分处于荧光态的荧光标记物集中分布在轴向几个或一个薄层内，大大抑制了厚样品成像时的背景噪声，提高了图像信息获取速率。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于光学显微成像技术，尤其涉及一种具有轴向选择性激发的荧光三维纳米分辨成像方法及装置。
技术介绍
众所周知，纳米分辨荧光成像可以以纳米的空间分辨率直观地显示被标记分子在 被标记物内的空间分布，并能用来研究被标记分子之间的相互作用过程，尤其可用来研究 细胞内DNA、RNA与蛋白质分子之间的相互作用和运动规律，是将细胞作为“试管”在位研究 主要生物大分子相互作用规律的重要工具。近年来出现了一类利用荧光标记物本身的开关 效应的荧光标记物定位显微技术，通过时分复用、质心定位以及图像复合来进行纳米分辨 成像，例如光敏定位显微(PALM)，随机光学重建显微(STORM)等等。它们在每个时刻获取稀 疏分布的荧光标记物的定位信息，然后将不同时刻获得的定位信息叠加，最终实现高横向 纳米分辨，如果结合轴向分辨辅助元件或方法，例如在探测光路引入柱面镜，或利用荧光自 干涉，或多焦面探测(MUM、dMUM)，还可以实现轴向的纳米分辨。然而，如果将这类分子定位显微直接用于厚达一二十微米甚至更厚的细胞成像， 来自非焦平面荧光分子产生的荧光信号将直接影响焦平面荧光分子的质心定位精度，从而 降低横向空间分辨率。正因为如此，目前这些方法大都以结合全内反射荧光显微(TIRF) 的方式实现，通过TIRF只激发表面的荧光分子，从而有效遏制了非焦平面的荧光信号。但 TIRF同时也带来一定的局限性，即这种成像方式只局限于细胞膜表面IOOnm左右范围内的 成像，应用范围受到很大限制。因此，对具有一定厚度的样品，例如细胞进行三维纳米分辨 成像时，通常的做法是将开关分子的稀疏程度降到很低的水平，单纯依靠轴向分辨以及轴 向扫描手段实现三维纳米分辨成像。但是，考虑到不同深度荧光开关分子信号的叠加对定 位精度会产生影响，这种成像方式对荧光态分子稀疏程度的要求大大增加；而且，非探测区 域内荧光分子的无效激发也使得这些分子面临过早被漂白的危险；同时，由于不同深度被 激发而发的荧光相互叠加，常常不得不抛弃一些发光点，从而进一步降低了图像信息的获 取速率，使获得完整三维图像的时间过长。单分子定位显微需要结合一些辅助手段实现三 维纳米成像。
技术实现思路
本专利技术实施例的目的在于提供一种高效的具有轴向选择性激发的荧光三维纳米 分辨成像方法及装置，旨在解决现有分子定位显微成像效率低的问题。本专利技术实施例是这样实现的，一种具有轴向选择性激发的荧光三维纳米分辨成像 方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤产生激发光和熄灭光，所述激发光和熄灭光分别由激发光源和熄灭光源产生；分光，将所述激发光分成第一激发光和第二激发光，将所述熄灭光分成第一熄灭 光和第二熄灭光；调整所述第一激发光与第二激发光之间的相位差和强度比，使所述第一激发光和第二激发光经相对放置的第一物镜和第二物镜后相干形成激发光轴向调制照明作用于样 品，所述样品内均勻分布有荧光标记物，其中所述第一激发光与第二激发光之间的相位差 为(2η+2) π，其中n为非负整数;调整所述第一熄灭光与第二熄灭光之间的相位差和强度比，使所述第一熄灭光和第二熄灭光经所述第一物镜和第二物镜后相干形成熄灭光轴向调制照明作用于所述样品， 其中所述第一熄灭光与第二熄灭光之间的相位差为(2η+1) π 士 δ，其中η为非负整数，δ 为所述第一熄灭光与第二熄灭光之间的相位差允许的误差值；探测荧光，由探测器探测所述荧光标记物发出的荧光；质心定位，根据探测到的荧光确定所述荧光标记物的二维位置；轴向扫描，轴向移动所述样品，或调整所述第一激发光与第二激发光之间的强度 比和所述第一熄灭光与第二熄灭光之间的强度比，使所述第一激发光与第二激发光和所述 第一熄灭光与第二熄灭光在所述样品的轴向不同位置实现所述轴向调制照明，探测所述荧 光标记物发出的荧光，从而确定所述荧光标记物的轴向位置；三维重构，结合所述荧光标记物的二维位置及轴向位置，获取所述样品的三维纳 米分辨图像。本专利技术实施例的另一目的是这样实现的，一种具有轴向选择性激发的荧光三维纳 米分辨成像装置，包括激发光源，用于产生激发光；熄灭光源，用于产生熄灭光；激发光分 光器件，用于将所述激发光源发出的激发光分成第一激发光和第二激发光；熄灭光分光器 件，用于将所述熄灭光源发出的熄灭光分成第一熄灭光和第二熄灭光；激发光光程调整装 置，用于调整所述第一激发光与第二激发光之间的光程差；激发光光强调整装置，用于调整 所述第一激发光与第二激发光之间的强度比；熄灭光光程调整装置，用于调整所述第一熄 灭光与第二熄灭光之间的光程差；熄灭光光强调整装置，用于调整所述第一熄灭光与第二 熄灭光之间的强度比；第一物镜和第二物镜，使所述第一激发光与第二激发光相对照射并 相干，同时使所述第一熄灭光与第二熄灭光相对照射并相干；微调样品台，用于放置和调 整具有荧光标记物的样品的位置，所述荧光标记物为具有开关效应的荧光分子或荧光分子 团；探测器，用于探测所述荧光标记物产生的荧光；多个镜片，用于调整光路及导出所述荧 光。本专利技术实施例中所述激发光源和熄灭光源发出的光分光后经过光强及光程调整 装置调整形成轴向调制照明作用于样品，所述样品内的荧光标记物发出荧光，所述轴向调 制照明使处于样品轴向中心位置的荧光标记物处于荧光态的概率最大，远离样品轴向中心 位置的荧光标记物处于荧光态的概率大大降低，实现了细胞等厚样品内荧光标记物的轴向 选择性激发，避免了荧光标记物定位显微用于细胞等厚样品成像时，不同层中处于荧光态 的荧光标记物的相互串扰，降低了单次成像中无效成像的荧光标记物数量，提高成像效率， 同时避免处于非探测层的荧光标记物的无效激发次数以及可能的光漂白。附图说明图1是本专利技术实施例提供的荧光三维纳米分辨成像装置的结构示意图；图2是本专利技术实施例提供的荧光三维纳米分辨成像装置的结构示意图(光源部分细化)；图3是本专利技术实施例中光程调整装置另一种结构示意图；图4是本专利技术实施例第一层次的轴向选择性激发中激发光和熄灭光形成的驻波 沿样品轴向的强度分布图；图5是本专利技术实施例第一层次的轴向选择性激发中荧光标记物处于荧光态的概 率沿样品轴向分布的曲线图；图6是本专利技术实施例更高层次的轴向选择性激发中激发光和熄灭光形成的驻波 沿样品轴向的强度分布图；图7是本专利技术实施例更高层次的轴向选择性激发中荧光标记物处于荧光态的概 率沿样品轴向分布的曲线图。具体实施例方式为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对 本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并 不用于限定本专利技术。如图1和图2所示，本专利技术实施例提供的荧光三维纳米分辨成像装置包括光源、分 光器、光强及光程调整装置、微调样品台和探测器以及若干镜片，样品内均勻分布有荧光标 记物。所述光源由激发光源38和熄灭光源39组成，与此相对应地，所述分光器具有激发光 分光器7和熄灭光分光器20，所述光强及光程调整装置具有激发光光强及光程调整装置和 熄灭光光强及光程调整装置。所述微调样品台15为压电陶瓷样品台。激发光和熄灭光的波 长均取决于所采用的荧光标记物的激发谱。一般来说，激发光波长在激发谱中激发较弱的 谱段选取；而熄灭光波长在激发谱中激发较强的谱段选取。本实施例以Cy5作为荧本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种具有轴向选择性激发的荧光三维纳米分辨成像方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：产生激发光和熄灭光，所述激发光和熄灭光分别由激发光源和熄灭光源产生；分光，将所述激发光分成第一激发光和第二激发光，将所述熄灭光分成第一熄灭光和第二熄灭光；调整所述第一激发光与第二激发光之间的相位差和强度比，使所述第一激发光和第二激发光经相对放置的第一物镜和第二物镜后相干形成激发光轴向调制照明作用于样品，所述样品内均匀分布有荧光标记物，其中所述第一激发光与第二激发光之间的相位差为（２ｎ＋２）π，其中ｎ为非负整数；调整所述第一熄灭光与第二熄灭光之间的相位差和强度比，使所述第一熄灭光和第二熄灭光经所述第一物镜和第二物镜后相干形成熄灭光轴向调制照明作用于所述样品，其中所述第一熄灭光与第二熄灭光之间的相位差为（２ｎ＋１）π±δ，其中ｎ为非负整数，δ为所述第一熄灭光与第二熄灭光之间的相位差允许的误差值；探测荧光，由探测器探测所述荧光标记物发出的荧光；质心定位，根据探测到的荧光确定所述荧光标记物的二维位置；轴向扫描，轴向移动所述样品，或调整所述第一激发光与第二激发光之间的强度比和所述第一熄灭光与第二熄灭光之间的强度比，使所述第一激发光与第二激发光和所述第一熄灭光与第二熄灭光在所述样品的轴向不同位置实现所述轴向调制照明，探测所述荧光标记物发出的荧光，从而确定所述荧光标记物的轴向位置；三维重构，结合所述荧光标记物的二维位置及轴向位置，获取所述样品的三维纳米分辨图像。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：陈丹妮，牛憨笨，于斌，
申请(专利权)人：深圳大学，
类型：发明
国别省市：94[中国|深圳]