乳制品中嗜酸乳杆菌活菌数字PCR定量检测方法技术

本发明专利技术公开了一种乳制品中嗜酸乳杆菌活菌数字PCR定量检测方法，使用以下引物和探针序列：正向引物NCFM P F2：TGCCGCCCTTGTAGTCTTTA；反向引物NCFM P R2：GGCAACTTGATCGCTTTACT；探针NCFM P2：TCGCATTAGTGTGCAACCCATCTGGA。本发明专利技术的乳制品中嗜酸乳杆菌ddPCR定量检测方法具有良好的特异性，同其他常见乳酸菌和食源性致病菌均无交叉反应。采用本发明专利技术的引物和探针组用于检测时，在整个定量检测动态范围内，针对嗜酸乳杆菌polA基因的测定结果变异系数CV均小于25％，满足国际上对核酸定量方法的验证要求，具有良好的重复性。好的重复性。好的重复性。

【技术实现步骤摘要】
乳制品中嗜酸乳杆菌活菌数字PCR定量检测方法


[0001]本专利技术属于微生物
，具体地说，是一种乳制品中嗜酸乳杆菌活菌数字PCR定量检测方法。

技术介绍

[0002]嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)是乳杆菌科中的乳杆菌属，为革兰氏阳性菌，形态呈细长杆状，最适生长温度为35℃～38℃，20℃以下不生长，耐热性差。嗜酸乳杆菌作为重要的益生菌被广泛用于食品中。Kumar等人发现嗜酸乳杆菌对大肠杆菌、腹泻致病菌等均有抑制作用；能降低血浆中的胆固醇含量；对乳糖不耐症有一定的疗效，对机体健康有促进作用等。嗜酸乳杆菌能在发酵过程中产生乳酸，并通过氨基酸代谢增加风味。在我国，饮料中添加益生菌特别是嗜酸乳杆菌成为新的发展趋势。
[0003]微滴式数字PCR技术(droplet digital polymerase chain reaction，ddPCR)是近年来新发展起来的定性定量分子检测新方法，用于转基因成分、食品中致病菌、掺假产品等的检测，以及在临床上用于肿瘤细胞的检测。1992年，Sykes等就首次提出了ddPCR的构想，是一项基于单分子目标基因PCR扩增的绝对定量技术，主要原理是将含有DNA模板的PCR反应体系分布到大量的独立反应室，单分子间通过大量稀释后分离，使得每个独立反应室中含有小于或等于一个拷贝，然后使这些反应室在相同条件下独自进行PCR扩增。含有DNA分子的微反应室能够发生PCR反应，即产生阳性信号；而不含DNA的微反应室则产生阴性信号，再利用泊松分布，逐一对阳性信号的微反应室计数，从而计算出样品中初始的DNA模板量。
[0004]ddPCR技术以其准确性好、灵敏度高、无需任何校准物质、可进行绝对定量等优势，已经在临床诊断、基因表达、环境微生物检测等方面得到了广泛的研究和应用。

技术实现思路

[0005]为实现对嗜酸乳杆菌的特异性检测和绝对定量分析，本申请的专利技术人选取了嗜酸乳杆菌具有种属特异性且高度保守的染色体单拷贝SPIDR区域的重复序列polA(GenBank No.CP054559.1)作为靶序列，设计了两组引物和探针组合。经qPCR验证，其对于嗜酸乳杆菌具有很好的特异性，并且经ddPCR验证，用于嗜酸乳杆菌检测时具有良好的重复性。
[0006]为此，本专利技术的第一个目的，在于提供一种乳制品中嗜酸乳杆菌活菌数字PCR定量检测方法，使用以下引物和探针序列：
[0007]正向引物NCFM P F2：TGCCGCCCTTGTAGTCTTTA；
[0008]反向引物NCFM P R2：GGCAACTTGATCGCTTTACT；
[0009]探针NCFM P2：TCGCATTAGTGTGCAACCCATCTGGA。
[0010]进一步的，所述数字PCR的反应体系如下：
[0011]ddPCR master mix for Probes(no dUTP)10μL，上、下游引物各1.5μL(终浓度900nmol/L)，探针0.5μL(终浓度250nmol/L)，样品DNA模板2μL，用双蒸水补足总体积20μL；
[0012]扩增反应条件：95℃预变性10min；94℃变性30s，55～60℃退火1min，45个循环；98℃固化微滴10min。
[0013]根据本专利技术的优选实施例，所述用于处理样品DNA的PMA的浓度为15μg/mL。
[0014]根据本专利技术的优选实施例，所述曝光的时间为15min。
[0015]根据本专利技术，所述数字PCR测定结果与对应样品的菌悬液浓度的换算公式如以下式(1)：
[0016][0017]式(1)中：C1为对应菌悬液浓度(CFU/mL)；N为20μL ddPCR反应体系中测得的核酸拷贝数(拷贝/20μL)；V1为提取核酸的最终定容体积(μL)；V2为ddPCR反应体系中加入的核酸模板体积(μL)；V3为提取的菌悬液体积(mL)。
[0018]本专利技术的第二个方面，提供了一种用于乳制品中嗜酸乳杆菌活菌数字PCR定量检测的引物和探针，其特征在于，所述引物和探针的序列如下：
[0019]正向引物NCFM P F2：TGCCGCCCTTGTAGTCTTTA；
[0020]反向引物NCFM P R2：GGCAACTTGATCGCTTTACT；
[0021]探针NCFM P2：TCGCATTAGTGTGCAACCCATCTGGA。
[0022]本专利技术具有以下有益效果：
[0023]1、本专利技术的乳制品中嗜酸乳杆菌ddPCR定量检测方法具有良好的特异性，同其他常见乳酸菌和食源性致病菌均无交叉反应。
[0024]2、本专利技术的乳制品中嗜酸乳杆菌ddPCR定量检测结果与GB 4789.35计数结果无显著统计学差异，定量限5.0lg CFU/g，适用于添加嗜酸乳杆菌的乳制品中嗜酸乳杆菌的快速定量检测。
[0025]3、采用本专利技术的引物和探针组用于检测时，在整个定量检测动态范围内，针对嗜酸乳杆菌polA基因的测定结果变异系数CV均小于25％，满足核酸定量方法的验证要求，具有良好的重复性。
附图说明
[0026]图1为使用两组引物和探针对表1所列菌株的DNA进行qPCR检测的结果。
[0027]图2显示了两组引物探针采用ddPCR对嗜酸乳杆菌(ATCC 4356)基因组DNA进行检测的结果。
[0028]图3显示了利用嗜酸乳杆菌对ddPCR检测体系中NCFM P F2/R2/P2引物探针组的特异性的验证结果，其中1
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4为4株嗜酸乳杆菌，5
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23为19株阴性菌株；24
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25为空白对照。
[0029]图4显示了不同浓度PMA处理的Ct值比较。
[0030]图5为高中低三个浓度嗜酸乳杆菌活菌和死菌组合的PMA
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ddPCR微滴分布图，其中，C03、D03：高浓度活菌高浓度死菌；E03、F03：高浓度活菌中浓度死菌；G03、H03：高浓度活菌低浓度死菌；A04、B04：中浓度活菌高浓度死菌；C04、D04：中浓度活菌中浓度死菌；E04、F04：中浓度活菌低浓度死菌；G04、H04：低浓度活菌高浓度死菌；A05、B05：低浓度活菌中浓度死菌；C05、D05：低浓度活菌低浓度死菌。
[0031]图6为人工添加活菌至多种样品基质的PMA
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ddPCR检测结果，其中：
[0032]A1和A2为奶粉基质，C03、E03：添加高浓度活菌(DNA模板稀释100倍后检测)，G03、H03：添加低浓度活菌，A06、B06：添加中浓度活菌；
[0033]B为酸奶基质，A04、B04：添加高浓度活菌(DNA模板稀释100倍后检测)，C04、D04：添加中浓度活菌，E04、F04：添加低浓度活菌；
[0034]C1和C2为干酪基质，G04、A05：添加高浓度活菌(DNA模板稀释100倍后检测)，B05、C05：添加中浓度活菌本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种乳制品中嗜酸乳杆菌活菌数字PCR定量检测方法，其特征在于，使用以下引物和探针序列：正向引物NCFM P F2：TGCCGCCCTTGTAGTCTTTA；反向引物NCFM P R2：GGCAACTTGATCGCTTTACT；探针NCFM P2：TCGCATTAGTGTGCAACCCATCTGGA。2.根据权利要求1所述的数字PCR定量检测方法，其特征在于:所述数字PCR的反应体系如下：ddPCR master mix for Probes(no dUTP)10μL，上、下游引物各1.5μL(终浓度900nmol/L)，探针0.5μL(终浓度250nmol/L)，样品DNA模板2μL，用双蒸水补足总体积20μL；扩增反应条件：95℃预变性10min；94℃变性30s，55～60℃退火1min，45个循环；98℃固化微滴10min。3.根据权利要求2所述的数字PCR定量检测方法，其特征在于，所述用于处理样品DNA...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘洋，张奕南，张娜娜，赵磊，杨捷琳，
申请(专利权)人：上海市质量监督检验技术研究院，
类型：发明
国别省市：