【技术实现步骤摘要】
带有GFP基因的重楼花叶坏死病毒侵染性克隆载体及其构建方法
[0001]本专利技术涉及植物病毒学和基因工程领域,具体的说,涉及一种带有GFP基因的重楼花叶坏死病毒侵染性克隆载体及其构建方法。
技术介绍
[0002]重楼又称七叶一枝花,是黑药花科(Melanthiaceae)重楼属(Paris)多年生草本植物,以干燥的根茎入药,具有清热解毒、消肿止痛、止血、凉肝定惊、调解免疫力等多种功效,用于治疗咽喉肿痛、毒蛇咬伤、跌打伤痛、凉风抽搐等症,是名贵的中药材。近年来随着中医药产业的发展,滇重楼需求量的增加,种植面积逐年扩大。云南是滇重楼的道地产区和主产区,2018种植面积突破11万亩。而随着人工大面积单一种植,病毒病成为限制重楼生产的主要因子之一。目前已报道的侵染重楼的病毒有11种,引起的主要症状有花叶、黄化、斑驳、坏死等,严重时致整株枯死。危害重楼的这些病毒中,重楼花叶坏死病毒(PMNV)是2017年在重楼上报道的一种马铃薯Y病毒科马铃薯Y病毒属成员,该病毒在重楼上主要引起叶片花叶、坏死等症状。
[0003]近年来PMNV在云南滇重楼上的发生较为普遍,平均检出率高达24.4%,是危害重楼的主要病毒,且寄主范围较广,还能侵染滇黄精、鬼针草和繁缕等重要药材和杂草。目前对PMNV的研究还处于起步阶段,其致病机制、传播方式均不明确,自然条件下重楼病毒病多为多种病毒复合侵染,很难获得单一的PMNV侵染的毒源,急需构建PMNV的侵染性克隆以研究该病毒的生物学特性、致病机制和相关基因的功能。
技术实现思路
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【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种带有GFP基因的重楼花叶坏死病毒侵染性克隆载体,其特征在于,所述侵染性克隆载体是利用酵母重组将PMNV全基因组RNA对应的cDNA全长序列克隆至pCB301
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HDV
‑2µ
载体的双35S启动子和终止子NOS之间,并把绿色荧光蛋白报告基因插入到PMNV的NIb蛋白和CP蛋白之间,即获得pCB301
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PMNV
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GFP重组载体。2.根据权利要求1所述的带有GFP基因的重楼花叶坏死病毒侵染性克隆载体的构建方法,其特征在于,包括以下步骤:(1) 通过PCR扩增获得重楼花叶坏死病毒全基因组的cDNA全长序列;(2)以质粒pCB301
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HDV
‑2µ
为模板,利用反向PCR扩增质粒pCB301
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HDV
‑2µ
,使质粒线性化,得到线性化pCB301
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HDV
‑2µ
载体;(3)以带GFP的TMV侵染性克隆载体为模板,扩增得到mGFP序列;(4)将重楼花叶坏死病毒cDNA全长序列、线性化pCB301
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HDV
‑2µ
载体以及mGFP序列,利用酵母同源重组技术进行连接后,共转化至酵母菌株Y2Hgold中;(5)筛选并提取步骤(4)中含pCB301
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HDV
‑2µ
载体序列及PMNV+GFP全长cDNA序列的质粒,即获得其侵染性克隆载体pCB301
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PMNV
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GFP。3.根据权利要求2所述的带有GFP基因的重楼花叶坏死病毒侵染性克隆载体的构建方法,其特征在于,所述步骤(1)中重楼花叶坏死病毒cDNA全长的获取是以感染了PMNV的重楼植株叶片为模板,使用引物PMNV(A)R反转录得到PMNV的cDNA,再使用PMNV特异引物扩增得到PMNV全基因组的cDNA序列,同时在病毒基因组的3
’
端加入56个A碱基;所述引物如下所示:PMNVF1:CAACTATACAAGACAATCAAATACAAACGCAGPMNVR1:ATTTACTACACCTGATACAACAAACAACCACPMNVF2:GTGGTTGTTTGTTGTATCAGGTGTAGPMNVR2:ACTACATAACCGTCGCTCACTGATACCPMNVF3:TATCAGTGAGCGACGGTTAT...
【专利技术属性】
技术研发人员:李凡,何鹏,兰平秀,谭冠林,陈小姣,罗恒明,
申请(专利权)人:云南农业大学,
类型:发明
国别省市:
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