一种铜纳米团簇模拟酶及检测胰蛋白酶的方法技术

本发明专利技术属于纳米材料及生物分析技术领域，涉及一种铜纳米团簇模拟酶及检测胰蛋白酶的方法。铜纳米团簇模拟酶的制备方法为：将铜盐与模板溶液混合，加入碱进行搅拌反应，反应后透析即得；所述模板溶液中采用的模板为金属纳米团簇模板；所述金属纳米团簇模板为包含功能性氨基酸序列的多肽；功能性氨基酸序列中至少含有两个半胱氨酸，功能性氨基酸序列的两个半胱氨酸之间含有赖氨酸。研究表明，胰蛋白酶能够显著增强本发明专利技术形成的铜纳米团簇模拟酶的过氧化物酶活性，从而实现对胰蛋白酶的检测。从而实现对胰蛋白酶的检测。从而实现对胰蛋白酶的检测。

【技术实现步骤摘要】
一种铜纳米团簇模拟酶及检测胰蛋白酶的方法


[0001]本专利技术属于纳米材料及生物分析
，涉及一种铜纳米团簇模拟酶及检测胰蛋白酶的方法。

技术介绍

[0002]公开该
技术介绍
部分的信息仅仅旨在增加对本专利技术的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
[0003]据专利技术人研究了解，目前检测胰蛋白酶的技术包括凝胶电泳、高效液相色谱、基于液晶的分析、酶联免疫测定等。然而，这些方法需要复杂的仪器、繁琐的程序，既昂贵又耗时，并且需要分子标记。金属纳米团簇被诱导自组装，可以引起某些特性(例如光学特性)的变化。金属纳米团簇的自组装可以通过改变温度、金属离子配位和溶液pH值来实现，特别是通过改变合成过程中使用的模板。金属纳米团簇的传感特性因模板不同而发生变化。然而目前对于金属纳米团簇通过诱导自组装来检测胰蛋白酶的研究较少。

技术实现思路

[0004]为了解决现有技术的不足，本专利技术的目的是提供一种铜纳米团簇模拟酶及检测胰蛋白酶的方法，本专利技术提供的模拟酶具有出低的过氧化物酶活性，加入胰蛋白酶可以快速增强以肽为模板合成的铜纳米团簇的过氧化物酶活性，催化H2O2与3,3,5,5
‑
四甲基联苯胺(TMB)迅速显色变成深蓝色，能够特异、灵敏、操作简便、快速检测人血清中的胰蛋白酶以及实现对胰蛋白酶抑制剂的选择。
[0005]为了实现上述目的，本专利技术的技术方案为：
[0006]一方面，一种金属纳米团簇模板，为包含功能性氨基酸序列的多肽；
[0007]所述功能性氨基酸序列中至少含有两个半胱氨酸，所述功能性氨基酸序列的两个半胱氨酸之间含有赖氨酸。
[0008]另一方面，一种铜纳米团簇模拟酶的制备方法，将铜盐与模板溶液混合，加入碱进行搅拌反应，反应后透析即得；所述模板溶液中采用的模板为上述金属纳米团簇模板。
[0009]第三方面，一种铜纳米团簇模拟酶，由上述制备方法获得。
[0010]研究表明，采用金属纳米团簇模板形成的铜纳米团簇模拟酶加入胰蛋白酶后，过氧化物酶活性快速增强。
[0011]第四方面，一种比色传感器，包括上述铜纳米团簇模拟酶。
[0012]铜纳米团簇模拟酶具有过氧化物酶活性，能够催化H2O2与TMB显色。尤其是多肽1形成的铜纳米团簇模拟酶加入胰蛋白酶后能够催化H2O2与TMB迅速显色变成深蓝色。
[0013]因而第五方面，一种上述铜纳米团簇模拟酶或比色传感器在制备胰蛋白酶检测试剂或检测胰蛋白酶中的应用。
[0014]第六方面，一种检测胰蛋白酶的方法，将上述铜纳米团簇模拟酶、H2O2与TMB加入至
溶液中，然后加入胰蛋白酶进行反应，对反应后溶液的吸光度进行检测。
[0015]第七方面，一种上述铜纳米团簇模拟酶或比色传感器在胰蛋白酶抑制剂筛选中的应用。
[0016]本专利技术的有益效果为：
[0017]本专利技术利用多肽来调控铜纳米簇的形貌和过氧化物酶活性。本专利技术利用胰蛋白酶特异性剪切赖氨酸羧基侧的肽键，从而使聚集的梭形多肽1基铜纳米团簇分解成单个纳米球，构建了一个稳健的比色传感平台，用于对胰蛋白酶的灵敏和选择性检测。胰蛋白酶抑制剂可以抑制胰蛋白酶活性的特点，也使胰蛋白酶抑制剂的筛选成为可能。该策略在临床诊断胰蛋白酶指示疾病以及筛选基于胰蛋白酶抑制剂的抗癌药物方面显示出巨大的潜在应用，极具现实意义。具体是：
[0018](1)不同的多肽可以调节以多肽为模板的铜纳米团簇的形貌和过氧化物酶活性。
[0019](2)梭形铜纳米团簇由含有两个半胱氨酸和两个半胱氨酸之间赖氨酸的肽制备，表现出较低的过氧化物酶活性，但当胰蛋白酶存在下，其过氧化物酶活性显著增加。
[0020](3)在胰蛋白酶增强过氧化物酶活性的基础上，建立了胰蛋白酶的比色传感，线性范围为3
‑
1000nM，检测限为0.82nM，低于迄今报道的大多数方法的检出限，可选择性检测人体血清样本中的胰蛋白酶。
[0021](4)胰蛋白酶抑制剂具有选择性抑制胰蛋白酶活性的特点，可以灵敏地筛选胰蛋白酶抑制剂。
[0022](5)所提出的方法具有特异性强、线性范围宽、灵敏度高、操作简便、安全性好、成本低等优点，通过对实际血清样品的检测证明该方法适用于对临床血清样品的检测，在医学免疫诊断和生物学研究等诸多领域开辟出一条有前景的检测方法。
附图说明
[0023]构成本专利技术的一部分的说明书附图用来提供对本专利技术的进一步理解，本专利技术的示意性实施例及其说明用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的不当限定。
[0024]图1为本专利技术中胰蛋白酶对多肽铜纳米团簇特异性切割的原理示意图。
[0025]图2为本专利技术实施例提供的不同多肽合成铜纳米团簇的形貌表征；A为多肽1基铜纳米团簇,(B)多肽2基铜纳米团簇，(C)多肽3基铜纳米团簇。
[0026]图3为本专利技术实施例提供的不同多肽合成铜纳米团簇与胰蛋白酶反应后的吸光值；A为多肽1基铜纳米团簇，a为加入胰蛋白酶前，b为加入胰蛋白酶后；B为多肽2基铜纳米团簇，a为加入胰蛋白酶前，b为加入胰蛋白酶后；C为多肽3基铜纳米团簇，a为加入胰蛋白酶前，b为加入胰蛋白酶后；D为多肽4基铜纳米团簇，a为加入胰蛋白酶前，b为加入胰蛋白酶后。
[0027]图4为本专利技术实施例提供的胰蛋白酶检测的选择性。
[0028]图5为本专利技术实施例提供的胰蛋白酶检测的工作曲线，A为可见光谱图，B为标准曲线。
[0029]图6为本专利技术实施例提供的胰蛋白酶抑制剂的筛选结果曲线，A为可见光谱图，B为标准曲线。
具体实施方式
[0030]应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本专利技术提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本专利技术所属
的普通技术人员通常理解的相同含义。
[0031]需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本专利技术的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
[0032]鉴于现有检测胰蛋白酶的多种技术需要复杂的仪器和繁琐的程序，既昂贵又耗时，并且需要分子标记。本专利技术提出了一种铜纳米团簇模拟酶及检测胰蛋白酶的方法。
[0033]本专利技术的一种典型实施方式，提供了一种金属纳米团簇模板，为包含功能性氨基酸序列的多肽；
[0034]所述功能性氨基酸序列中至少含有两个半胱氨酸，所述功能性氨基酸序列的两个半胱氨酸之间含有赖氨酸。
[0035]该实施方式的一些实施例中，所述金属纳米团簇模板为多肽1，多肽1的氨基酸序列为ACGLKTWWYNCGGGGS。
[0036]本专利技术的另一种实施方式，提供了一种铜纳米团簇模拟酶的制备方法，将铜盐与模板溶液本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种金属纳米团簇模板，其特征是，为包含功能性氨基酸序列的多肽；所述功能性氨基酸序列中至少含有两个半胱氨酸，所述功能性氨基酸序列的两个半胱氨酸之间含有赖氨酸。2.如权利要求1所述的金属纳米团簇模板，其特征是，所述金属纳米团簇模板为多肽1，多肽1的氨基酸序列为ACGLKTWWYNCGGGGS。3.一种铜纳米团簇模拟酶的制备方法，其特征是，将铜盐与模板溶液混合，加入碱进行搅拌反应，反应后透析即得；所述模板溶液中采用的模板为权利要求1所述的金属纳米团簇模板。4.如权利要求3所述的铜纳米团簇模拟酶的制备方法，其特征是，所述铜盐为硫酸铜；或，碱为氢氧化钠；或，包括以下步骤：(1)将硫酸铜溶液加入到多肽溶液中搅拌处理得到混合溶液I；(2)将氢氧化钠溶液加入混合溶液I中搅拌得到混合溶液II；(3)将得到的混合溶液II过夜透析即得；优选地，所述步骤(1)中，硫酸铜溶液的摩尔浓度为0.1～1.0mM；搅拌时间为5～15分钟；优选地，所述步骤(2)中，所述氢氧化钠的摩尔浓度为0.5～1.5mM，搅拌具体条件为：在30～40℃、搅拌1～10小时；优选地，步骤(3)中所需透析袋截留分子量为3000，透析时间控制为12
‑
36小时。5.一种...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘爱骅，蔡园园，
申请(专利权)人：青岛大学，
类型：发明
国别省市：