用于冠心病诊断的血管过氧化物酶ＥＬＩＳＡ试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种用于冠心病诊断的血管过氧化物酶ＥＬＩＳＡ试剂盒，发明专利技术人制备ＶＰＯ１融合蛋白，以及抗人ＶＰＯ１多克隆抗体，并在此基础上提供一种灵敏度高、特异性强、使用方便、快速的定量检测人血清、血浆、脑脊液或其他人组织匀浆中的血管过氧化物酶浓度的ＥＬＩＳＡ试剂盒。用ＥＬＩＳＡ方法直接测定样品中的ＶＰＯ１含量，用于冠心病的风险筛查和诊断，该试剂盒检测灵敏度小于５．０ｎｇ／ｍｌ，剂量－反应曲线的线性相关系数＞０．９８０，具有简便、快捷、灵敏、准确的优点，为体外诊断定量检测血管过氧化物酶提供了有效的手段。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及血管过氧化物酶(VP01)蛋白及抗体，特别涉及用于冠心病诊断的包 含VP01蛋白及抗体ELISA试剂盒。
技术介绍
冠心病是严重危害人类健康的常见病，在我国冠心病的发病率和死亡率呈逐年上 升趋势，心肌梗死已成为我国病人主要死因之一，且其发病出现明显低龄化趋势。动脉粥样 硬化是冠心病的病理生理基础，其发病机制复杂，涉及氧化应激、脂质代谢紊乱，炎症反应 等，其中脂质过氧化是近来的研究热点。 髓过氧化物酶(MPO)存在于中性粒细胞和单核巨噬细胞中，MPO可以氧化低密度 脂蛋白(LDL)成为氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)，是目前已知的一种催化脂质过氧化的重 要酶类。临床研究表明，血液和单核细胞中的MPO水平与急性冠脉综合征的发生以及胸痛 存在明显的正相关，目前，MPO已成为动脉粥样硬化内皮功能不全及急性冠脉综合征预后的 一个重要的预测因子。血管过氧化物酶(VPO)是一种新的过氧化物酶，其与MPO在结构上 有44. 5%的同一性。VPO存在两种形式，其中VP01主要在人体的心脏和血管中表达。
技术实现思路
本专利技术旨在通过对VP01的进一步研究，提供一种VP01融合蛋白，以及抗人VP01 多克隆抗体，并在此基础上提供一种灵敏度高、特异性强、使用方便、快速的定量检测人血 清、血浆、脑脊液或其他人组织匀浆中的血管过氧化物酶浓度的ELISA试剂盒，用于冠心病 临床诊断。 为实现上述专利技术目的，本专利技术的详细技术方案为以含VPOl基因(NCBI的geneID :69675)的质粒为模板，根据原核表达载体pEGX_4T_2的GST阅读框架设计引物，使VP01基因的编码区阅读框与GST的阅读框架一致，并使引物带有Sail和Notl酶切位点，进行PCR扩增，切胶后，经凝胶回收线性的4. 9kb的VP01编码区片段；用所述PCR回收产物及pEGX-4T-2载体进行Sail和Notl双酶切，产生匹配的粘末端，之后将pEGX_4T_2载体与VP01基因连接，构建成符合阅读框的GST-VP01融合基因；用含融合基因的pEGX-4T-2-VP01质粒转化大肠杆菌BL21，挑选阳性菌落，提取纯化获得重组融合蛋白。 以上述VPOl融合蛋白免疫温血动物后，制备出抗人VPOl多克隆抗体。 —种血管过氧化物酶ELISA试剂盒，包括样品稀释液、酶底物显色液、浓縮洗涤液、封闭液和终止反应液，还包括上述VP01融合蛋白、上述的抗人VP01抗体包被的酶标板，以及酶标记二抗。 专利技术人首次在冠心病患者血清中发现VP01的表达升高，同时在体外实验中证实 VP01可以氧化LDL成为ox-LDL，从而促进动脉粥样硬化的形成。VP01与MP0相似，具备作为 冠心病诊断和治疗的生化标记物的特点。在此基础上，本专利技术用生物工程方法制备出VP01 融合蛋白及抗人VP01抗体，并建立ELISA试剂盒，用ELISA方法直接测定样品中的VP01含量，用于冠心病的风险筛查和诊断。该试剂盒检测灵敏度小于5. Ong/ml，剂量-反应曲线的 线性相关系数> 0. 980，具有简便、快捷、灵敏、准确的优点，为体外诊断定量检测血管过氧 化物酶提供了有效的手段。附图说明 图1是VP01融合蛋白的诱导表达的电泳图； 图2是VP01融合蛋白提取纯化的电泳图； 图3是VP01剂量(浓度)-反应(吸光度)曲线。具体实施例方式以下结合实施例进一步说明本专利技术。 实施例1 :血管过氧化物酶ELISA试剂盒的制备 1. VP01标准品的制备 据原核表达载体pEGX-4T-2的GST阅读框架设计引物，使VP01基因的编码区阅 读框与GST的阅读框架一致。以含VP01基因的质粒为模板(0. 1 ii g)，以分别带有Sail和 NotI醇切位点的弓l物Forward :5' -gatagtcgacatcacctggaacaaggatgg_3' :Reverse :5' _这 tgcggccgctggctectagacacgttcac-3，各lO咖ol进行扩增，切胶后，经凝胶回收线性的4. 9kb 的载体，即为VP01编码区片段。用上述PCR回收产物及pEGX-4T-2载体进行Sail和NotI 双酶切，产生匹配的粘末端，之后将pEGX-4T-2载体与VP01基因连接，构建成符合阅读框的 GST-VP01融合基因。用含融合基因的pEGX-4T-2-VP01质粒转化大肠杆菌BL21，小量制备 质粒DNA，并以Sail和NotI双酶切鉴定是否含插入片段，含插入片段的阳性克隆质粒DNA 纯化后，经DNA自动测序仪测序证实其序列正确性。 单个阳性菌落接种入含氨卞青霉素(lOOii g/ml)的2ml LB培养液中，37。C，过夜 培养。将400 ii 1过夜培养物分别接种到40ml含氨卞青霉素(100 y g/ml)的LB培基中，于 37t:培养7h，加入IPTG至终浓度为lmmol/L， 37°C ，培养2. 5h，转移至50ml离心管中。室温 12000 Xg离心10min，去尽上清，置于冰上，重悬于预冷的600ii1的PBS中。加入终浓度为 100iig/ml的溶菌酶、10ii g/ml DNase I，用液氮和温水介导的反复冻融法破膜，11000rpm 离心10min，收集上清。重悬GST MicroSpin纯化柱中的树脂，打开盖及底盖，置于干净的 1.5ml的离心管中，735Xg离心lmin，弃液体，盖上底盖，柱中加入600 yl的细菌裂解液。 盖紧上盖，轻轻混匀，置于室温5 10min后打开盖及底盖，置于干净的1. 5ml的离心管中， 735Xg离心lmin，再用400iU PBS用相同的方法洗涤2次。柱中加入200 yl的谷胱苷肽 洗脱液，盖紧上盖，轻轻混匀，置于室温5 10min。 735Xg离心lmin收集流出液。诱导后 的菌液超声破碎裂解后，SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝R-250染色鉴定其纯度为99% ;剩余部 分菌液离心，用QIAGEN公司Ni-NTAAgarose试剂盒进行重组融合蛋白纯化，将沉淀的菌体 重悬于5mL Buffer B中，超声破碎一冻溶处理4次；超声破碎每次10s，间歇15S， 10次/周 期。4°C 12000r/min离心30min，收集上清，加入用Buffer B平衡过的Ni-NTA琼脂糖珠， 4。C轻柔振荡30min ;用漂洗缓冲液Buffer C、 D依次清洗Ni-NTA琼脂糖珠，最后用Buffer E对Ni-NTA琼脂糖珠进行洗脱，收集洗脱液，进行SDS-PAGE电泳检测(参见图1和图2)。 2.抗人VPOl抗体的制备 将含有1. Omg/mlVPOl溶液1. Oml与相同体积的完全Freund' s佐剂混匀，完全乳化后，从纯系新西兰白兔背部的四个不同部位各皮下注射0. 5ml ;4周后，每只白兔皮下注射入浓度为1. Omg/ml的VPOl溶液1. Oml与相同体积不完全Freund' s佐剂混匀完全乳化的乳液，加强免疫； 2周后进行第二次加强免疫；第二次加强免疫10天后从白兔的耳缘静脉处放血，收集约40ml的静脉血。以后每隔2周进行一次加强免疫，每次加强免疫后10天采血，直至血量明显减少，抗体滴度下降为止。将兔血在室温下静置数小本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种ＶＰＯ１融合蛋白，其特征在于通过以下制备方法获得：以含ＶＰＯ１基因的质粒为模板，根据原核表达载体ｐＥＧＸ－４Ｔ－２的ＧＳＴ阅读框架设计引物，使ＶＰＯ１基因的编码区阅读框与ＧＳＴ的阅读框架一致，并使引物带有ＳａｌＩ和ＮｏｔＩ酶切位点，进行ＰＣＲ扩增，切胶后，经凝胶回收线性的４．９ｋｂ的ＶＰＯ１编码区片段；用所述ＰＣＲ回收产物及ｐＥＧＸ－４Ｔ－２载体进行ＳａｌＩ和ＮｏｔＩ双酶切，产生匹配的粘末端，之后将ｐＥＧＸ－４Ｔ－２载体与ＶＰＯ１基因连接，构建成符合阅读框的ＧＳＴ－ＶＰＯ１融合基因；用含融合基因的ｐＥＧＸ－４Ｔ－２－ＶＰＯ１质粒转化大肠杆菌ＢＬ２１，挑选阳性菌落，提取纯化获得重组融合蛋白。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张国刚，石瑞正，成光杰，曹淑红，陈嘉，柏勇平，
申请(专利权)人：中南大学，
类型：发明
国别省市：43[中国|湖南]