一种猪δ冠状病毒S1蛋白的中和抗原表位及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种猪δ冠状病毒S1蛋白表位及其应用，其中猪δ冠状病毒S1蛋白表位肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明专利技术针对PDCoV免疫显性结构域S1

【技术实现步骤摘要】
一种猪
δ
冠状病毒S1蛋白的中和抗原表位及其应用


[0001]本专利技术具体涉及一种猪δ冠状病毒S1蛋白表位及其应用。

技术介绍

[0002]根据系统发育关系和基因组结构，可将冠状病毒分为四个属：α、β、γ和δ属。猪δ冠状病毒(Porcine deltacoronavirus，PDCoV)属于δ属，其临床症状与其它三种猪α冠状病毒相似，包括：猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)、传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus，TGEV)和猪急性腹泻综合征冠状病毒(Swine acute diarrhea syndrome coronavirus，SADS
‑
CoV)，均可导致哺乳仔猪严重腹泻、呕吐、脱水和死亡。PDCoV具有广泛的宿主嗜性，可感染犊牛、鸡、火鸡和老鼠，更重要的是，Lednicky J A等人最近报道了三例海地儿童感染PDCoV的病例。这些发现表明了该病毒具有在种间传播的潜力，可能对人类健康造成威胁。因此，迫切需要研制安全有效的疫苗及抗病毒药物，以帮助控制PDCoV的流行。
[0003]PDCoV基因组长度约为25kb，编码的蛋白质包括：ORF1a/b、纤突蛋白(spike protein，S)、小膜蛋白(small membrane protein，E)、膜蛋白(membrane protein，M)、非结构蛋白6(nonstructural protein 6，NS6)、核衣壳蛋白(nucleocapsid protein，N)、非结构蛋白7(nonstructural protein 7，NS7)和非结构蛋白7a(nonstructural protein 7a，NS7a)。S蛋白是冠状病毒表面的三聚体1型糖蛋白。在感染过程中，宿主蛋白酶将S蛋白裂解成Sl和S2亚基。S1蛋白参与受体的识别和结合，包含C端和N端结构域(分别为S1
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CTD和S1
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NTD)。S2亚基介导病毒与细胞膜的融合。研究发现疫苗诱导的中和抗体强弱与冠状病毒感染易感动物后的病毒载量高低之间有很强的相关性。冠状病毒S蛋白是主要诱导宿主机体产生中和抗体的结构蛋白，因此S蛋白常作为冠状病毒疫苗研究的一个关键靶蛋白。PDCoV S蛋白中S1
‑
NTD(aa50
ꢀ‑
286)、S1
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CTD(aa278
ꢀ‑
616)和S2(aa601
ꢀ‑
1087)三个区域已被证实均可以诱导机体产生中和抗体，其中S1
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CTD是主要的免疫显性结构域，可诱导产生较其它两个区域更强的中和抗体，因此S1
‑
CTD区域是PDCoV疫苗开发的一个关键靶点。
[0004]预防性疫苗的本质是通过人为引入病毒抗原，利用自身免疫系统，对靶抗原的表位进行识别、免疫放大及记忆，进而产生持久且特异的体液及细胞免疫。因此，一种理想的疫苗是能够有效唤起免疫系统的体液和细胞免疫。然而，研制CoVs疫苗的一个重要安全问题是抗体依耐增强效应(antibody
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dependent enhancement，ADE)。病毒入侵后，机体会产生特异性中和抗体，抑制病毒感染细胞，但在特定情况下，病毒与非中和抗体或亚中和抗体结合，反而促进病毒感染细胞，这种现象被称为ADE。目前大量研究表明当机体产生过多的非中和抗体，或者体内中和抗体水平较低时，病毒的再次感染就有可能会引起ADE效应。因此，诱导高效中和抗体产生，减轻ADE的不良影响，是冠状病毒疫苗研究的一个重要方向。为了避免ADE效应，基于表位的疫苗或强中和性单克隆抗体是很好的选择，但目前还缺乏基于PDCoV的S1
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CTD区域表位的研究，以获得安全高效的疫苗或抗病毒药物。

技术实现思路

[0005]为解决上述问题，本专利技术提供了一种猪δ冠状病毒S1蛋白表位肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示：FYSDPKSAV。
[0006]本专利技术还提供了一种前述表位肽在制备预防和/或治疗猪δ冠状病毒感染的药物中的用途。
[0007]本专利技术还提供了一种预防猪δ冠状病毒的疫苗，它是以前述的表位肽为抗原，加上药学上可接受的载体制备而成的疫苗。
[0008]进一步地，所述载体为具有免疫原性的蛋白载体；所述蛋白载体包括钥孔血蓝蛋白。
[0009]本专利技术还提供了一种前述疫苗的制备方法，它包括如下步骤：取前述的表位肽，与钥孔血蓝蛋白偶联，即得。
[0010]本专利技术还提供了一种单克隆抗体，它是经猪δ冠状病毒S1
‑
CTD蛋白激活后的B细胞，与骨髓瘤细胞融合形成的杂交瘤细胞产生并分泌的抗体。
[0011]进一步地，所述抗体识别猪δ冠状病毒S1蛋白中表位S
280
‑
288
；所述表位S
280
‑
288
的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示：FYSDPKSAV。
[0012]本专利技术还提供了一种制备前述单克隆抗体的方法，它包括如下步骤：
[0013]取杂交瘤细胞注射于小鼠腹腔，5～8d抽取腹水，离心，取上清液采用硫酸铵盐析法提取，提取液用Protein G亲和层析柱纯化，即得；
[0014]所述杂交瘤细胞是猪δ冠状病毒S1
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CTD蛋白激活后的B细胞与骨髓瘤细胞融合形成的能产生并分泌识别猪δ冠状病毒S1蛋白中表位S
280
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288
的细胞；所述S
280
‑
288
表位的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示：FYSDPKSAV。
[0015]进一步地，所述小鼠为BALB/c小鼠。
[0016]本专利技术还提供了一种前述单克隆抗体在制备预防和/或治疗猪δ冠状病毒感染的药物中的用途。
[0017]本专利技术最后提供了一种预防和/或治疗猪δ冠状病毒感染的药物，它是以前述的单克隆抗体为活性成分，加上药学上可接受的辅料制备而成的制剂。
[0018]本专利技术所述“猪δ冠状病毒S1
‑
CTD蛋白”是猪δ冠状病毒S蛋白S1亚单位的C端结构域，一般认为S1
‑
CTD结合蛋白类受体。
[0019]本专利技术针对PDCoV免疫显性结构域S1
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CTD区域，利用细胞融合以及亚克隆筛选，成功获得了一株针对PDCoV S1
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CTD蛋白的单克隆抗体4E
‑
3，经病毒中和试验及噬斑减少中和试验证明，该单克隆抗体能够在体外中和PDCoV，其IC50分别为3.612μg/mL与3.155μg/mL。此外，利用肽扫描技术鉴定出单克隆抗体4E
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3识别的抗原表位为
280
FYSDPKSAV...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种猪δ冠状病毒S1蛋白表位肽，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.权利要求1所述表位肽在制备预防和/或治疗猪δ冠状病毒感染的药物中的用途。3.一种预防猪δ冠状病毒的疫苗，其特征在于：它是以权利要求1所述的表位肽为抗原，加上药学上可接受的载体制备而成的疫苗。4.根据权利要求3所述的疫苗，其特征在于：所述载体为具有免疫原性的蛋白载体；所述蛋白载体包括钥孔血蓝蛋白。5.一种权利要求4所述疫苗的制备方法，其特征在于：它包括如下步骤：取权利要求1所述的表位肽，与钥孔血蓝蛋白偶联，即得。6.一种单克隆抗体，其特征在于：它是经猪δ冠状病毒S1
‑
CTD蛋白激活后的B细胞，与骨髓瘤细胞融合形成的杂交瘤细胞产生并分泌的抗体。7.根据权利要求6所述的单克隆抗体，其特征在于：所述抗体识别猪δ冠状病毒S1蛋白中表位S
280
‑
288
表位；所述S
280
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【专利技术属性】
技术研发人员：黄小波，陈汭，曹三杰，
申请(专利权)人：四川农业大学，
类型：发明
国别省市：