一种肺腺癌与肺鳞癌鉴别的肿瘤标志物及其鉴别方法，所述标志物为人附睾分泌蛋白4（HE4），所述HE4异常高表达显著促进了肺癌细胞的生长、克隆形成、迁移和侵袭能力。与正常癌旁组织相比，发现HE4主要在肺腺癌细胞中高表达，而在肺鳞癌细胞中低表达，从而鉴定肺癌尤其鉴别肺腺癌与肺鳞癌，本发明专利技术通过HE4表达水平来鉴定和鉴别肺癌尤其肺腺癌与肺鳞癌特征，从而可以快速诊断非小细胞肺癌及其亚型。可以快速诊断非小细胞肺癌及其亚型。可以快速诊断非小细胞肺癌及其亚型。
【技术实现步骤摘要】
一种肺腺癌与肺鳞癌鉴别的肿瘤标志物及其鉴别方法
[0001]本专利技术涉及一种用于鉴定肺癌尤其鉴别肺腺癌与肺鳞癌的肿瘤标志物及其鉴别方法，属于生物医学分析领域。
技术介绍
[0002]肺癌是癌症导致死亡的主要恶性肿瘤之一，可分为两大类：小细胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC)和非小细胞肺癌(non
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small cell lung cancer,NSCLC)。NSCLC占肺癌病例的85％，其又分为3种主要病理亚型：腺癌(Lung adenocarcinoma，LUAD)，鳞状细胞癌(Lung squamous carcinoma，LUSC)和大细胞癌(Large
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cell lung carcinoma，LCLC)。
[0003]目前，分子靶向疗法、含或不含贝伐单抗的铂类双联疗法和免疫疗法是肺癌的主要治疗手段。近几十年，肺癌的治疗策略已从传统治疗的放、化疗逐步过渡到个性化精准靶向治疗，例如酪氨酸激酶抑制剂，其专门针对个体患者的酪氨酸激酶突变的靶标。
[0004]人类附睾蛋白4(humanepididymisprotein4,HE4)是属于WFDC(以前称为WAP)家族的分泌型糖基化蛋白，也称为乳清酸性蛋白4
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二硫键核心结构域2。WAP四
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二硫键核心结构域2(WFDC2)，即编码HE4的基因，位于人染色体20q12
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13.1位点上，在卵巢癌、结肠癌和肺癌中经常发现其扩增。HE4在其他组织中的作用仍不清楚，有人认为它可能参与呼吸道、鼻腔和口腔的先天免疫防御。
[0005]已知的肺癌标志物，例如癌胚抗原、血清细胞角蛋白19片段和前胃泌素释放肽，由于其相对较低的敏感性和低特异性，用于检测肺癌的效果并不理想。有研究表明NSCLC患者血清HE4水平明显高于对照组，HE4高表达与肿瘤转移分期、淋巴结转移和远处转移相关；其次，有研究发现血清HE4水平高与肺癌患者的5年生存率成负相关(34.0％比59.7％；p＝0.022)；最后，多元Cox模型分析发现HE4表达是非小细胞肺癌5年整体OS的独立不良预后因素，因此，血清HE4表达水平适合预测NSCLC患者的预后。这些研究结果表明HE4可能是NSCLC潜在的诊断和预后标志物。
技术实现思路
[0006]本专利技术的目的是通过如下技术方案来完成的，一种鉴别肺腺癌与肺鳞癌寻找新的肿瘤标志物，所述标志物为人附睾分泌蛋白4(HE4)，所述HE4通过高表达显著促进了肺癌细胞的生长、克隆形成、迁移和侵袭能力，并发现HE4在肺腺癌细胞中高表达，而在肺鳞癌细胞中表达差异不明显，从而鉴定肺癌尤其鉴别肺腺癌与肺鳞癌。
[0007]一种鉴别肺腺癌与肺鳞癌的鉴别方法，所述方法包括如下步骤：
[0008]a.分别将正常肺细胞株、肺鳞癌细胞株、与肺腺癌细胞株裂解，western blotting；
[0009]b.将肺腺癌肿瘤组织、肺鳞癌肿瘤组织及癌旁正常临床组织样本裂解，western blotting；
[0010]c.使用TCGA数据库分析HE4在肺腺癌与肺鳞癌细胞中的表达情况；
[0011]d.使用慢病毒HE4 shRNA分别感染肺腺癌PC
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9和H1975细胞株，嘌呤霉素筛选10天建立稳定表达HE4 shRNAH1975细胞株以及瞬时感染HE4 shRNA 6天PC
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9细胞株，制备蛋白裂解液，western blotting检测HE4表达；
[0012]e.嘌呤霉素筛选10天建立稳定表达HE4 shRNAH1975与A549细胞株细胞株以及瞬时感染HE4 shRNA 6天PC
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9细胞株，提取细胞RNA，q
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PCR检测HE4在PC
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9、H1975与A549中的转录水平；
[0013]f.瞬时感染HE4 shRNA 3天与6天，MTT检测HE4敲低对PC
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9、A549与H1975细胞活力的影响并定量分析；
[0014]g.嘌呤霉素筛选10天建立稳定表达HE4 shRNA细胞株，MTT实验检测HE4敲低对
[0015]A549与H1975细胞活力的影响并定量分析；
[0016]h.嘌呤霉素筛选10天建立稳定表达HE4 shRNA细胞株A549与H1975以及瞬时感染
[0017]HE4 shRNA 6天细胞株PC
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9，细胞成像检测细胞增殖；
[0018]i.嘌呤霉素筛选10天建立稳定表达HE4 shRNA细胞株A549与H1975以及瞬时感染
[0019]HE4 shRNA 6天细胞株PC
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9，细胞克隆形成实验并定量分析；
[0020]j.嘌呤霉素筛选10天建立稳定表达HE4 shRNA细胞株A549与H1975以及瞬时感染
[0021]HE4 shRNA 6天细胞株PC
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9，细胞划痕分析细胞迁移；
[0022]k.嘌呤霉素筛选10天建立稳定表达HE4 shRNA细胞株A549与H1975以及瞬时感染
[0023]HE4 shRNA6天细胞株PC
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9，基质胶transwell分析细胞侵袭；
[0024]l.嘌呤霉素筛选10天建立稳定表达HE4 shRNA细胞株A549与H1975以及瞬时感染HE4 shRNA6天细胞株PC
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9,基质胶transwell检测细胞侵袭的定量分析。
[0025]本专利技术通过人附睾分泌蛋白4HE4的鉴定解决了非小细胞肺癌亚型肺腺癌和肺鳞癌特征，从而可以快速的判断肿瘤发展情况。
附图说明
[0026]图1是正常肺细胞株、肺腺癌和肺鳞癌细胞株中HE4蛋白的表达情况；
[0027]图2是癌旁正常组织和肺癌肿瘤样本中HE4表达水平检测；
[0028]图3是TCGA数据库分析WFDC2(HE4)在肺腺癌和肺鳞癌中的表达情况；
[0029]图4是慢病毒介导的shRNA敲低HE4蛋白表达情况；
[0030]图5是慢病毒介导的shRNA敲低HE4转录水平分析；
[0031]图6是瞬时敲低HE4对肺癌细胞的增殖影响的定量分析；
[0032]图7是稳定敲低HE4对肺癌细胞的增殖影响的定量分析；
[0033]图8是敲低HE4对肺癌细胞的细胞生长及形态的影响情况；
[0034]图9是敲低HE4对肺癌细胞的克隆形成能力影响情况；
[0035]图10是敲低HE4对肺癌细胞克隆形成影响的定量分析；
[0036]图11是敲低HE4对肺癌细胞的迁移能力影响情况；
[0037]图12是敲低HE4对肺癌细胞的侵袭能力影响及定量分析。
具体实施方式
[0038]下面将结合具体实例以及附图对本专利技术作详细介绍，本专利技术在实施中选用本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种肺腺癌与肺鳞癌鉴别的肿瘤标志物，其特征在于：所述标志物为人附睾分泌蛋白4(HE4)，所述高表达HE4显著促进了肺癌细胞的生长、克隆形成、迁移和侵袭能力，并发现HE4在肺腺癌患者中高表达，而在肺鳞癌中低表达，从而鉴定肺癌尤其鉴别肺腺癌与肺鳞癌。2.一种利用权利要求1所述的鉴别肺腺癌与肺鳞癌的鉴别方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：a.分别将正常肺细胞株、肺鳞癌细胞株和肺腺癌细胞株裂解，western blotting；b.将肺腺癌肿瘤组织、肺鳞癌肿瘤组织及癌旁正常临床组织样本裂解，western blotting；c.使用TCGA数据库分析HE4在肺腺癌与肺鳞癌细胞中的表达情况；d.使用慢病毒HE4 shRNA分别感染肺腺癌PC
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9和H1975细胞株，嘌呤霉素筛选10天建立稳定表达HE4 shRNAH1975细胞株以及瞬时感染HE4 shRNA6天PC
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9细胞株，制备蛋白裂解液，western blotting检测HE4表达；e.嘌呤霉素筛选10天建立稳定表达HE4 shRNAH1975与A549细胞株以及瞬时感染HE4 shRNA6天PC
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9细胞株，提取细胞RNA，q
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PCR检测HE4在PC
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9、H1975与A549中的转录水平；f.瞬时感染HE4...
【专利技术属性】
技术研发人员：韩肖旺，唐仟，欧文斌，
申请(专利权)人：浙江理工大学，
类型：发明
国别省市：
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