本发明专利技术公开了水稻生长素运输蛋白基因ＯｓＰＩＮ２的基因工程应用，属于基因工程领域。水稻生长素运输蛋白基因ＯｓＰＩＮ２的核苷酸序列及其表达ＯｓＰＩＮ２蛋白氨基酸序列在ＮＣＢＩ网站（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）登录号为ＡＫ１０１１９１。该基因的工程应用为水稻中的首次报道，参与水稻生长素的运输，增大水稻根系、分蘖数、分蘖角度、氮素利用效率以及最终产量。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术公开了水稻生长素运输蛋白基因0sPIN2的基因工程应用，属于基因工程
，具体地讲涉及水稻中编码生长素运输蛋白及其调控的基因应用。
技术介绍
氮素是作物重要的大量营养元素之一，参与生物体各种代谢过程。它是植物体中 很多生命物质的组成成分，比如氨基酸、蛋白质、核酸、酶、叶绿素等。氮分别占植物体干 重的1. 5-2%和植物总蛋白的16% (Frink CR. ， Waggoner PE. and Ausubel JH. Nitrogen fertilizer :retrospect and prospect. Proc. Nati. Acad. Sci. USA. 1999. 96 :1175 1180.)。目前，中国氮肥用量占全球氮肥用量的30% (彭少兵，黄见良，钟旭华，杨建昌，王 光火，邹应斌，张福锁，朱庆森，Roland Buresh，Christian Witt.提高中国稻田氮肥利用率 的研究策略.中国农业科学.2002，35(9) :1095 1103.)，成为世界第一大消费国。其中 水稻田中氮肥的施用量超过其它任何农作物，氮肥的损失量占施肥总量的70%。我国普遍 存在着由于氮肥利用率低和大量的氮素损失导致的一系列环境问题。水稻虽然喜铵作物， 但是已经有研究表明一定量的硝态氮能够促进水稻对铵的吸收，而且在水稻生长发育的后 期田里和旱作水稻主要以硝态氮为主。 水稻的根系发育受硝酸盐调控，其中主要硝酸盐促根系生长的机制是硝酸盐调控 了生长素的运输分布。研究表明细胞和细胞之间的IAA极性运输是IAA运输蛋白来完成的。 其中IAA内流运输蛋白有AUX1和LAX(AUXl-like)基因家族，外流运输蛋白基因有PIN基 因家方矣(Eiichi. Regulation of rootgrowth by plant hormones-roles for auxin and gibberelin. Critical Reviews in Plant Science, 2005， 24 (4) :249-265.)。拟南芥PINl 突变体对IAA的运输能力下降且不能形成正常的花序(0kada K， JunichiU， Komaki MK， Bell CJ and Shimura Y. Requirement of the Auxin Polar Transport System in Early StagesofArabidopsis Floral Bud Formation.The Plant Cell, 1991，3(7) :677-684.)， PIN2突变体导致根系向重力性消失(Muller A，Guan CH，Galweiler L，Tanzler P，Huijser P， Marchant A， Parry G， Bennett M， Wisman M and Palme K. AtPIN2defines a locus of Arabidopsis for root gravitropism control.The EMBOJournal. 1998，17 (23): 6903-6011.)水稻中0sPINl在植株的地上地下部均有表达，而0sPIN2只在根尖及根茎结合 处表达(Wang JR， Hu H， Wang GH， Li J， Chen JY and Wu P Molecular Plant. Expression ofPIN Genes in Rice(0ryza sativa L) :Tissue Specificity and Regulation by Hormones. 2009,2(4) :823-831.)。通过转基因的方法过量或抑制表达0sPINl都要会导 致水稻根冠比的变化(XuM， Zhu L， Shou H and Wu P. Plant Cell Physiol. A PINlfamily gene， OsPINl， involved in 肌xin—d印endentadventitious root emergence and tillering in rice. 2005， 46 (10) : 1674-1681.)，但并未报道对氮素利用效率及产量性状 的改善。本专利技术首次公开了过量表达生长素运输蛋白基因0sPIN2对水稻根系、株型的调控 有很大作用，能够提高水稻对氮肥的利用率、改善水稻株型、增加水稻的产量。
技术实现思路
技术问题 本专利技术的目的旨在提供水稻生长素运输蛋白基因0sPIN2的基因工程应用，该基 因在水稻中过量表达可以增大水稻根系、分蘖数量、分蘖角度、氮素利用效率和最终水稻产 技术方案 本专利技术提供了水稻生长素运输蛋白基因0sPIN2的基因工程应用，基因登录号是 AK101191，该基因在调节作物根系发育，分蘖数目、分蘖角度，提高氮肥利用效率及最终产 量方面的应用。包括 1)总RNA的提取水稻日本晴种子经质量比30% NaClO消毒，催芽，培养到二叶一 心时，挑选出大小一致的水稻植株，去掉胚乳后移栽至pH5. 5的1/2国际水稻所IRRI营养 液中，四叶一心时换为国际水稻所IRRI全营养液，培养一周后，取根及叶片迅速置于液氮 中冷冻保存，称取0. lg左右样品，用液氮研碎，研磨充分加入1. 5ml离心管，迅速加入lml Trizol试剂，加入0. 2mL氯仿，离心后吸取上清，加入0. 5mL异丙醇，离心后弃上清，加入 70%乙醇洗涤沉淀，RNA溶于DEPC水中(体积比为1%。)，用质量比为1. 7%的琼脂糖凝胶 电泳检测RNA质量，并用分光光度计检测总RNA的浓度和纯度； 2)总cDNA合成每个RNA样品2 y g，加入50 y molL—"01igo dT18，加1%。 DEPC水补 足10ii L，70。C下水浴5min，冰上放置5min后，依次加入RNase inhibitor 0. 5 ii L和5xRT buffer 5 ii L， 10mM dNTP2. 5 ii L， M-MLV反转录酶1 ii L， 1%。 DEPC水补足25 ii L，42"C水浴 60min后，70。C水浴10min终止反应； 3)0sPIN2基因的cDNA全长的获得用以上获得的水稻日本晴总cDNA为模板，设计PCR引物，其PCR产物包含完整的 0sPIN2阅读框(从起始密码子ATG至3'端非编码区)，引物序列为 PIN2-F:5' —ATGATCACCGGACGCGACATC-3，； PIN2-R:5' -GGAATCTTTAGTACCGCCAACCC-3' PCR程序如下94t:预变性4min，98t:变性10s，68"C复性延伸2min，30个循环后， 72°C 10min，扩增的PCR产物通过1 %琼脂糖凝胶电泳检测，其大小为2203bp片段，将目的 PCR产物经琼脂糖电泳分离后切胶回收，将回收的片段与pMD-19载体连接，酶连体系总体 积10 ii L，包含5 ii L连接液，1 y L的pMD-19载体，3_4 y L的PCR纯化产物，用水补足10 y L， 然后16t:连接过夜； 再转入大肠杆菌DH5 a感受态细胞中涂在含本文档来自技高网...
【技术保护点】
水稻生长素运输蛋白基因ＯｓＰＩＮ２的基因工程应用。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：范晓荣，徐国华，陈赢男，张亚丽，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：84[中国|南京]
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