一种用于Furin活性定量检测的比率多肽防污电化学传感器的制备方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种用于Furin活性定量检测的比率多肽防污电化学传感器的制备方法及应用。本发明专利技术同时也公开了采用制备的比率多肽防污电化学传感器进行Furin活性定量检测的方法，特别是在特异性对人乳腺癌细胞MDA

【技术实现步骤摘要】
一种用于Furin活性定量检测的比率多肽防污电化学传感器的制备方法及应用


[0001]本专利技术属于分析
，涉及一种可特异性识别检测Furin的新型比率多肽防污电化学传感器。特别是一种基于大环化合物的可用于Furin活性定量检测的比率多肽防污电化学传感器的制备及应用。

技术介绍

[0002]Furin作为一种可分泌蛋白酶，主要存在于高尔基体外侧的网络中，是真核生物细胞内一种重要的内源性蛋白酶。它负责许多前体蛋白的加工，作用底物广泛，包括大多数肽类激素、生长因子受体、凝血因子以及金属基质蛋白酶等等，具有重要的生物学功能和研究价值。Furin的异常表达与许多疾病的发生有着密切联系。特别是在大脑内，Furin对其底物的激活和剪切，影响着人神经生理活动的进行，对于某些精神类疾病的发生起着重要的调节作用。研究表明，Furin可以活化α分泌酶、抑制β分泌酶，而这两种酶均可对引起阿尔兹海默病的淀粉样前体蛋白进行裂解，由此影响着疾病发展的进程。因此，开发一种能够准确有效检测Furin活性的方法，对于进一步探究Furin的生理功能以及在相关疾病中的发挥作用来说，均具有重要的意义。
[0003]Furin可识别特定的氨基酸序列，这为采用电化学方法检测提供了可能性。多肽电化学传感器因多肽的选择性好和结构灵活等特点而在生物大分子的检测上展示出良好的应用前景。但在复杂生物介质的检测环境下，由生物大分子非特异性吸附造成的传感器污染是必须要解决的问题之一。为此，许多研究报道了多肽防污序列，其是带有正负电荷的氨基酸交替排列组成的，由于强烈的水合作用，可抵抗蛋白吸附。但是，多肽的本质是由氨基酸通过肽键共价连接形成的聚合物，真实样本中存在的蛋白酶会破坏肽键，催化多肽水解，降低传感器的稳定性和使用寿命。所以，目前已开发的多肽防污电化学传感器还存在着一定的局限性。

技术实现思路

[0004]为了克服现有技术的上述缺陷，本专利技术公开了一种基于大环化合物的可用于Furin活性定量检测的比率多肽防污电化学传感器的制备方法，其特征在按如下步骤进行：步骤1，直径为3 mm的玻碳电极(GCE)使用氧化铝粉末打磨至表面光滑，依次在乙醇和去离子水中超声清洗后在室温下吹干，得到前处理的玻碳电极；步骤2，在步骤1得到的玻碳电极表面滴涂碳纳米管分散液(CNT)，碳纳米管分散液由DMF:H2O=1：1的溶剂分散而成，浓度为0.5
‑
5 mg/mL，红外灯下干燥，得到CNT/GCE；在氯金酸溶液中，使用电沉积的方法在CNT/GCE表面修饰金纳米粒子(AuNPs)，得到AuNPs/CNT/GCE；将AuNPs/CNT/GCE浸泡在浓度为1 μM，修饰时间为30 min
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5 h，的亚甲基蓝溶液(MB)中修饰参比分子，得到MB/AuNPs/CNT/GCE；最后，将电极浸入预先使用浓度为5
‑
30 mM的三(2
‑
羧乙基)膦(TCEP)处理的特异性识别多肽(peptide)的溶液中处理8
‑
16h，得到peptide/MB/
AuNPs/CNT/GCE修饰电极；所述氯金酸的浓度为5 mM，电沉积电位为
‑
0.2 V，电沉积时间为10
‑
100 s；步骤3，使用1
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乙基
‑
（3
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二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺(EDC)和N
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羟基丁二酰亚胺(NHS)作为催化剂，EDC和NHS催化剂浓度比为2
‑
6：1，活化多肽序列中游离的羧基，使信号分子氨基二茂铁(Fc
‑
NH2)通过酰胺键反应配位到电极表面，再将其置入水溶性四联苯硫酸盐溶液(MC)中，在4℃条件下孵育2
‑
48h，得到比率多肽防污电化学传感器；所述信号分子Fc
‑
NH2浓度为1 mg/mL，所用溶剂为乙醇，处理时间为1
‑
5 h。
[0005]本专利技术同时也公开了采用上述方法制备的比率多肽防污电化学传感器进行Furin活性定量检测的方法其特征在按如下步骤进行：步骤1，将Furin标准样品或相应细胞裂解液用浓度为10 mM ，pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液(PBS)稀释成不同浓度；步骤2，将制备好的比率多肽防污电化学传感器浸入步骤1制备的溶液中孵育10
‑
50 min，孵育温度为4℃，使Furin切断多肽序列上的识别位点，释放信号分子；步骤3，将步骤2中孵育好的电极用PBS缓冲溶液冲洗后作为工作电极，Ag/AgCl作参比电极和Pt电极作对电极组成三电极体系，进行电化学测量；所述电化学测量为获得差分脉冲伏安图（DPV），参数设置为：扫描范围，
‑
0.6 V
ꢀ‑ꢀ
0.6 V；振幅，0.05 V；脉冲周期，0.5 s；电位增量为4.0mV。
[0006]本专利技术更进一步公开了采用上述方法制备的比率多肽防污电化学传感器在特异性用于人乳腺癌细胞MDA
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MB
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468和人胶质瘤细胞U251两种Furin过表达的癌细胞中Furin活性检测的应用，实验结果显示：使用该方法制备的传感器进行电化学检测得到的结果与传统酶联免疫吸附试验得到的测试结果相比非常吻合，证明了该方法的可靠性和实用性。
[0007]本专利技术更加详细的描述如下：本专利技术公开了一种基于大环化合物的可用于Furin活性定量检测的比率多肽防污电化学传感器的制备方法，包括以下步骤：步骤1，玻碳电极使用氧化铝粉末打磨至表面光滑，依次在乙醇和去离子水中超声清洗后在室温下吹干，得到前处理的玻碳电极。
[0008]步骤2，在步骤1得到的玻碳电极表面滴涂碳纳米管分散液，红外灯下干燥，得到CNT/GCE使用电沉积的方法在CNT/GCE表面修饰AuNPs，得到AuNPs/CNT/GCE；将AuNPs/CNT/GCE浸泡在MB溶液中修饰参比分子，得到MB/AuNPs/CNT/GCE；最后，将电极浸入特异性识别多肽的溶液（预先使用TCEP处理）中处理一段时间，得到peptide/MB/AuNPs/CNT/GCE修饰电极。
[0009]步骤3，使用EDC和NHS作为催化剂，活化多肽序列中游离的羧基，使信号分子Fc
‑
NH2通过酰胺键反应配位到电极表面，再将其置入水溶性四联苯硫酸盐溶液中，在4℃条件下进行孵育，得到比率多肽防污电化学传感器。
[0010]其中，步骤1所述玻碳电极的直径为3 mm。
[0011]其中，步骤2所述碳纳米管分散液由DMF:H2O=1：1的溶剂分散而成，浓度为0.5
‑
5 mg/mL，优选地，为2 mg/mL。
[0012]其中，步骤2所述氯金酸的浓度为5 mM，电沉积电位为
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0.2 V，电沉积时间为10
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100 s，优选地，为50 s。
[0013]其中，步骤2所述MB溶液的浓度为1本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于大环化合物的可用于Furin活性定量检测的比率多肽防污电化学传感器的制备方法，其特征在按如下步骤进行：步骤1，直径为3 mm的玻碳电极使用氧化铝粉末打磨至表面光滑，依次在乙醇和去离子水中超声清洗后在室温下吹干，得到前处理的玻碳电极；步骤2，在步骤1得到的玻碳电极表面滴涂碳纳米管分散液，碳纳米管分散液由DMF:H2O=1：1的溶剂分散而成，浓度为0.5
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5 mg/mL，红外灯下干燥，得到CNT/GCE；在氯金酸溶液中，使用电沉积的方法在CNT/GCE表面修饰AuNPs，得到AuNPs/CNT/GCE；将AuNPs/CNT/GCE浸泡在浓度为1 μM的MB溶液中修饰参比分子，修饰时间为30 min
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5 h，得到MB/AuNPs/CNT/GCE；最后将电极浸入预先使用浓度为5
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30 mM TCEP处理的特异性识别多肽的溶液中处理8
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16h，得到peptide/MB/AuNPs/CNT/GCE修饰电极；所述氯金酸的浓度为5 mM，电沉积电位为
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0.2 V，电沉积时间为10
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100 s；步骤3，使用EDC和NHS作为催化剂，EDC和NHS催化剂浓度比为2
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6：1，活化多肽序列中游离的羧基，使信号分子Fc
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NH2通过酰胺键反应配位到电极表面，再...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵凡，兰景悦，
申请(专利权)人：天津师范大学，
类型：发明
国别省市：