用于预防和治疗贫血的方法以及组合物技术

本发明专利技术涉及用于预防和治疗贫血的方法以及组合物。具体地说，本发明专利技术公开了提高以及维持哺乳动物血细胞比容的方法，该方法包括给予高糖基化红细胞生成素类似物。为了获得相当的目标血细胞比容并治疗贫血，给予类似物的频度低于给予等摩尔量的重组人红细胞生成素的频度。或者给予较低摩尔量高糖基化类似物就可获得相当的目标血细胞比容并治疗贫血。本发明专利技术还公开了新的高糖基化红细胞生成素类似物、生产该类似物的方法以及包含该类似物的组合物。（*该技术在2019年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
用于预防和治疗贫血的方法以及组合物 本申请是申请日为1999年10月18日，申请号为99814697. 8，专利技术名称为用于预防和治疗贫血的方法以及组合物的专利技术专利申请的分案申请。专利
本专利技术涉及应用高糖基化红细胞生成素类似物提高哺乳动物血细胞比容。更具体地说，本专利技术涉及较低频度给予高糖基化类似物(与重组人红细胞生成素相比)以提高以及维持血细胞比容并治疗贫血。本专利技术还涉及以相同给药频率给予较低剂量高糖基化类似物(与重组人红细胞生成素相比)以提高以及维持血细胞比容并治疗贫血。还提供新的高糖基化红细胞生成素类似物。 专利技术背景 红细胞生成素(Epo)是红细胞类祖细胞成熟为红细胞必需的糖蛋白激素。它在肾脏产生，主要调节循环红细胞水平。特征为低水平组织氧体征的情况增加Epo产生，它再剌激红细胞生成。例如见于慢性肾功能衰竭(CRF)的肾功能障碍通常导致Epo产生减少，同时红细胞减少。 Miyake等(T. Biol. Chem. 252, 5558 (1977))从再生障碍性贫血患者纯化人尿Epo。但是，从该来源获得的纯化Epo蛋白量不足以进行治疗应用。Lin在美国专利第4， 703， 008号中公开了鉴定以及克隆编码人Epo的基因以及表达重组蛋白，该专利公开内容通过引用结合到本文中。Lai等在美国专利第4， 667， 016号中公开了从细胞培养基纯化重组人红细胞生成素的方法，将其通过引用结合到本文中。已由哺乳动物宿主细胞产生生物活性Epo，首次获得适合治疗用途的Epo量。此外，对所述基因序列的了解以及纯化蛋白的生物利用度提高使得可以更好地了解该蛋白的作用模式。 人尿来源的Epo(Miyake等，同上)和在哺乳动物细胞中表达的重组人Epo均含有3个N-联和1个0-联寡糖链，它们一起约占所述糖蛋白总分子量的40% 。 N-联糖基化发生于位于位置24、38和83的天冬酰胺残基，而O-联糖基化发生于位于位置126的丝氨酸残基(Lai等，.T. Biol. Chem. 261,3116(1986) ;Broudy等，Arch. Biochem. Bioohys. 265,329 (1988))。已经证实所述寡糖链在末端被唾液酸残基修饰，通常N-联链最高每链可含有4个唾液酸，而0-联链最高可含有2个唾液酸。所以Epo多肽最高总共可以接纳14个唾液酸。 各种研究已经表明，改变Epo糖链可影响生物活性。然而在一个研究中，单独去除N-联或0-联寡糖链或者通过诱变为糖基化位点的天冬酰胺或丝氨酸残基一起去除N-联或0-联寡糖链明显降低在哺乳动物细胞中产生的改变的Epo的体外活性(Dube等，J. Biol.Chem. 263,17516 (1988))。然而，DeLorme等(Biochemistry紅，9871-9876 (1992))报道去除Epo N-链糖基化位点降低体内生物活性而不是体外生物活性。 通过测定分离的Epo同种型的体内活性可揭示Epo唾液酸含量和其体内生物活性的关系。以等摩尔浓度的分离的Epo同种型提高正常小鼠的血细胞比容的能力测定，发现每个Epo分子的唾液酸含量逐渐提高导致相应的Epo体内生物活性逐渐提高(Egrie等，Glycoconjugate J.边，263 (1993))。此外，具有较高唾液酸含量的Epo同种型的血清半衰 期更长，但是与Epo受体的亲和力降低，提示血清半衰期是体内生物活性的重要决定因素。 在Epo多肽中导入新的糖基化位点可产生具有额外糖链的分子。参见PCT公开号 W091/05867和W094/09257，将其通过引用全部结合到本文中。公开了具有至少一个额外 N-联糖链和/或具有至少一个额外0-联糖链的Epo糖基化类似物。测定发现，与重组人 Epo(rHuEpo)(同种型9_14)和每个分子含有14个唾液酸的纯化同种型rHuEpo相比，含有 一个额外N-联链的糖基化类似物的循环半衰期更长。 给予重组人红细胞生成素(rHuEpo)可有效提高终末期肾病贫血患者的红细胞水 平(Eschbach等，New Eng. J. Med. M旦，73-38 (1987))。随后的研究表明，用rHuEpo治疗可 校正与各种其它疾病有关的贫血。(Fischl等，New Eng. .T. Med. 322,1488-1493 (1990)): La卯acis， LancetMi， 1228-1232(1993)。有关条例已经批准rHuEpo用于治疗CRF伴随的 贫血、HIV感染患者采用AZT(齐多夫定)治疗引起的贫血、接受化疗的非骨髓性恶性肿瘤 患者的贫血以及外科手术患者的贫血，从而减少对同种异体输血的需要。对所有批准适应 症(除了外科适应症)的现有疗法包括初始给药剂量为50-150单位/kg，静脉(IV)或皮下 (SC)注射，每周3次(TIW)，以达到所提出的目标血细胞比容范围。对于外科适应症，手术 前10天、手术当天以及手术后4天每天给予rHuEpo(EP0GEN Package Insert, 12/23/96)。 一般来说，目前的rHuEpo推荐起始剂量在约6-8周内使血细胞比容升高到目标范围。达到 目标血细胞比容范围后确立维持剂量方案，维持剂量方案随患者而不同，但是CRF贫血患 者通常为每周3次。上述给予rHuEpo是治疗贫血的有效而且患者耐受性良好的方案。 最好是有比rHuEpo效力更强的治疗药物。这种分子的优势应该是给药频率和/ 或剂量更低。贫血患者的现有治疗方法需要每周给予EP0GEN 3次，而外科患者需要每天 给药一次。较低给药频度的治疗方案对医生和患者均更方便，尤其是对不能按规定方案到 医生办事处或诊所看病的患者或自我注射Epo的患者尤为方便。更有效分子的另一个好处 是使较少的药物进入患者体内就可达到相当的血细胞比容的升高。 所以本专利技术目的之一是鉴定更有效的治疗贫血的分子，它可提供给药频度较低的 方案。本专利技术再一 目的是提供当给予较低剂量时可以提高并维持至少与Epo相当的血细胞 比容水平的分子。本专利技术再一目的是所选定的给药频率更小的这些分子的耐受性至少与 rHuEpo —样好，甚至在某些患者的耐受性可能更好。 专利技术概述 已发现当给药剂量和频率与rHuEpo相同时，称为N47 (Asn3°Thr32Val87Asn88Thr90Ep o)的高糖基化Epo类似物的血清半衰期较重组人红细胞生成素(rHuEpo)更长，而且其体内 活性更高。此外，已经证实该类似物在小鼠以每周给予1次与每周给予3次rHuEpo升高的 血细胞比容相同。在小鼠和人类给予Epo类似物N47的药代动力学相似。 本专利技术提供升高并维持哺乳动物血细胞比容的方法，包括给予有效治疗量的Epo 高糖基化类似物的药用组合物，其中所述类似物比获得相当目标水平的血细胞比容的等摩 尔量rHuEpo的给药频率更低。为了达到患者的最佳血细胞比容范围，本专利技术的给药频率低 于每周3次。给药频率可以为每周2次，每周1次，或低于每周1次，例如每隔1周1次，每 月l次或每两个月l次。维持患者目标血细胞比容需要的给药频率低于每周3次。给药频 率可以为每周2次，每周1次，或低于每周1次，例如每隔1周1次，每月1次或每两个月1 5次。 本专利技术还提本文档来自技高网...

【技术保护点】
有效量高糖基化红细胞生成素类似物在制备提高并维持哺乳动物血细胞比容的药物中的用途，其中所述类似物的给药频率低于获得相似目标血细胞比容的等摩尔量重组人红细胞生成素的给药频率。

【技术特征摘要】
US 1998-10-23 09/178292书宗旨和范围包括的各种改进实施方案 和等同实施方案，本发明范围与最广义的解释一致，以包括所有这样的改进和等同实施方案。序列表〈110>Amegn:nc.〈120〉用于预防和治疗贫血的方法以及组合物〈130>A-460〈140>09/178， 292〈141>1998-10-23〈160>5〈170〉Patentln Ver. 2. 0〈210>1〈211>193〈212>PRT〈213〉人〈220〉〈221〉SIGNAL〈222〉 (1) (27)〈223〉信号序列是残基1-27〈400>1Met Gly ValHis Glu CysProAlaTrpLeuTrpLeuLeuLeuSerLeu151015Leu Ser LeuPro Leu GlyLeuProValLeuGlyAlaProProArgLeu202530lie Cys AspSer Arg ValLeuGluArgTyrLeuLeuGluAlaLysGlu354045Ala Glu Asnlie Thr ThrGlyCysAlaGluHisCysSerLeuAsnGlu505560Asn lie ThrVal Pro AspThrLysValAsnPheTyrAlaTrpLysArg65707580Met Glu ValGly Gin GinAlaValGluValTrpGinGlyLeuAlaLeu20859095Leu Ser Glu AlaValLeuArgGlyGin Ala Leu Leu Val AsnSerSer100105 110Gin Pro Trp GluProLeuGinLeuHis Val Asp Lys Ala ValSerGly115120125Leu Arg Ser LeuThrThrLeuLeuArg Ala Leu Gly Ala GinLysGlu130135140Ala lie Ser ProProAspAlaAlaSer Ala Ala Pro Leu ArgThrlie145150155160Thr Ala Asp ThrPheArgLysLeuPhe Arg Val Tyr Ser AsnPheLeu165170175Arg Gly Lys LeuLysLeuTyrThrGly Glu Ala Cys Arg ThrGlyAsp180185 190Arg〈210〉2〈211〉29〈212〉DNA〈213〉人<400〉2atctagaagt tgctctctgg acagttcct29〈210〉3<211〉32〈212〉DNA〈213〉人〈400>3g朋gcttgcg ccacc3tggg ggtgcacgaa tg 32〈210〉4<211〉27〈212>DNA〈213〉人〈400〉4gatcctctag agttgctctctggacag27〈210〉5〈211>25〈212〉DNA〈213〉人〈400〉5caacaagctt gcgccgccat ggggg权利要求有效量高糖基化红细胞生成素类似物在制备提高并维持哺乳动物血细胞比容的药物中的用途，其中所述类似物的给药频率低于获得相似目标血细胞比容的等摩尔量重组人红细胞生成素的给药频率。2. 权利要求l的用途，其中所述高糖基化红细胞生成素类似物量的给予是约每周2次。3. 权利要求l的用途，其中所述高糖基化红细胞生成素类似物量的给予是约每周l次。4. 权利要求l的用途，其中所述高糖基化红细胞生成素类似物量的给予是约每隔一周 l次。5. 权利要求l的用途，其中所述高糖基化红细胞生成素类似物量的给予是约每月l次。6. 权利要求3的用途，其中所述高糖基化红细胞生成素类似物给予量约O. 075-4. 5 ii g 红细胞生成素肽/kg/剂。7. 有效量高糖基化红细胞生成素类似物在制备提高并维持哺乳动物血细胞比容的药 物中的用途，其中以低于获得相似目标血细胞比容的重组人红细胞生成素的摩尔量给予所 述类似物。8. 权利要求7的用途，其中所述高糖基化红细胞生成素类似物的给予量是约 0. 025-1. 5 ii g红细胞生成素肽/kg/齐U，每周3次。9. 权...

【专利技术属性】
技术研发人员：JC埃格里，SG埃利奥特，JK布朗，
申请(专利权)人：安姆根有限公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]