一种针对ARPC5基因、抑制肿瘤增殖和转移的shRNA及其应用制造技术

本发明专利技术涉及针对ARPC5基因、抑制肿瘤增殖和转移的shRNA，其碱基序列如SEQ ID No.1所示，即：5

【技术实现步骤摘要】
一种针对ARPC5基因、抑制肿瘤增殖和转移的shRNA及其应用


[0001]本专利技术属于生物
,涉及一个能通过RNA干扰途径特异降低细胞内ARPC5基因表达量的发夹型小干扰RNA(ARPC5 shRNA)的序列；以及利用这种发夹型小干扰RNA(shRNA)对ARPC5基因进行特异性干扰后抑制细胞增殖和转移的作用，尤其是抑制肝癌细胞系(HepG2)增殖和转移的作用。

技术介绍

[0002]癌症患者发生转移是死亡的重要原因，肿瘤细胞侵袭周围组织是肿瘤发生转移的先决条件。侵袭细胞迁移需要细胞本身形成特殊结构，包括侵袭性伪足。侵袭性伪足的形成主要依赖于肌动蛋白聚合，由于聚合的调控与ARP2/3复合体息息相关，因此越来越多的研究者关注于肌动蛋白聚合调控因子ARP2/3复合体在肿瘤细胞中的作用。
[0003]深入研究侵袭性伪足形成及调控机制对于以肿瘤转移为靶点的新型抗代谢药物的研发至关重要。
[0004]ARPC5是一个新近发现的基因，越来越多的研究着眼于ARP2/3复合体的最小亚基ARPC5。在肝细胞癌多株细胞系中下调其靶基因ARPC5可以导致其细胞骨架肌动蛋白重组，表现为细胞变圆及空泡状细胞形态，最终导致癌细胞侵袭及迁移能力下降。作为癌基因的ARPC5可能参与了肿瘤侵袭转移机制的调控，其在肿瘤中的研究越来越受关注。
[0005]ARPC5是由155个氨基酸构成，分子量为16kDa。目前认为ARPC5蛋白与肿瘤增殖及转移呈正相关。其中ARPC5在肿瘤基因组图谱TCGA数据库中显示肝癌高表达，并且ARPC5表达越高，预后越差。
[0006]最近的研究结果表明，ARPC5在促进肿瘤细胞增殖和黏附侵袭的过程中发挥重要作用。因此，抑制ARPC5基因的转录和表达可能是抑制肿瘤细胞增殖和转移的有效方法。
[0007]shRNA(short hairpin RNA)是“短发夹RNA”，shRNA包括两个短反向重复序列，中间由一茎环(loop)序列分隔的，组成发夹结构，由polⅢ启动子控制。随后再连上5
‑
6个T作为RNA聚合酶Ⅲ的转录终止子。利用shRNA干涉基因可以克服siRNA作用时间短暂的缺点，是一种稳定沉默基因的方法。

技术实现思路

[0008]本专利技术的目的是提供一种针对ARPC5基因、抑制肿瘤增殖和转移的shRNA及其应用，该shRNA可以特异性抑制人ARPC5基因表达。
[0009]本专利技术的技术解决方案是：一种针对ARPC5基因、抑制肿瘤增殖和转移的shRNA，其碱基序列如SEQ ID No.1所示，即：5
’‑
CCGGGUCCAUUGUUCGUGUCUUGAC CUCGAGGUCAAGACACGAACAATGGACUUUUU
‑3’
。
[0010]前述针对ARPC5基因、抑制肿瘤增殖和转移的shRNA，针对的靶序列如SEQ ID No.2所示，即GUCCAUUGUUCGUGUCUUGAC。
[0011]前述shRNA通过如SEQ ID No.3或4所示的DNA寡核苷酸链转录生成，即
[0012]5’‑
CCGGGTCCATTGTTCGTGTCTTGACCTCGAGGTCAAGACACGAACAATGGACTTTTT
‑3’
或
[0013]5’‑
AATTAAAAAGTCCATTGTTCGTGTCTTGACCTCGAGGTCAAGACACGAACAATGGAC
‑3’
[0014]前述该shRNA通过包含如SEQ ID No.3或4所示的DNA寡核苷酸链的质粒转录生成。
[0015]前述shRNA在制备抑制肿瘤细胞增殖和转移的药物中的应用。
[0016]将本专利技术发夹型干扰RNA(ARPC5 shRNA)转染入人肝癌细胞系后，ARPC5基因和蛋白的表达量明显降低，并能抑制细胞增殖能力，黏附能力和侵袭能力，并且能抑制细胞在裸鼠皮下瘤的增长，具有潜在的治疗肿瘤的价值。这段shRNA能够通过RNA干扰途径(RNAi)，特异性降低人肝癌细胞系(HepG2)中基因ARPC5的表达，从而显著抑制HepG2细胞的增殖和转移。该发夹小RNA可以应用于抑制肿瘤细胞增殖和转移的药物中。
附图说明
[0017]图1是实验流程图。
[0018]图2是RT
‑
PCR检测ARPC5基因shRNA转染人肝癌细胞系HepG2，ARPC5基因mRNA水平的RT
‑
PCR结果，ARPC5 shRNA为转染ARPC5 shRNA的细胞，control shRNA为转染无关序列shRNA的细胞。
[0019]图3是Western
‑
blot检测ARPC5基因shRNA转染人肝癌细胞系HepG2，ARPC5基因蛋白表达水平，ARPC5 shRNA为转染ARPC5 shRNA的细胞，control shRNA为转染无关序列shRNA的细胞。
[0020]图4是细胞计数检测ARPC5基因shRNA转染后，细胞增殖能力的变化。
[0021]图5是细胞黏附实验检测ARPC5基因shRNA转染后，细胞黏附能力的变化。
[0022]图6是细胞侵袭实验检测ARPC5基因shRNA转染后，细胞侵袭能力的变化。
[0023]图7是裸鼠皮下瘤实验检测ARPC5基因shRNA转染后，细胞接种皮下瘤增殖速度的变化。
[0024]图8是裸鼠皮下瘤实验检测ARPC5基因shRNA转染后，细胞接种皮下瘤增殖水平的变化。
[0025]图9是细胞免疫荧光实验检测ARPC5基因shRNA转染后，细胞骨架微丝网络的变化图一。
[0026]图10是细胞免疫荧光实验检测ARPC5基因shRNA转染后，细胞骨架微丝网络的变化图二。
具体实施方式
[0027]实验流程如图1所示：
[0028]1.针对ARPC5基因shRNA的设计与合成：根据ARPC5基因全长mRNA序列，经分析设计，我们选择了ARPC5基因全长mRNA序列(BC057237)第528～548碱基处，共21个核苷酸为靶向干涉的序列，被识别的具体序列如SEQ ID No.2所示，即：GCAAGAAGAAGTGTGGTCACA。针对该序列我们设计合成了一段高特异性的shRNA，该shRNA通过如SEQ ID No.3或4所示的DNA寡核苷酸链转录生成，即
[0029]5’‑
CCGGGTCCATTGTTCGTGTCTTGACCTCGAGGTCAAGACACGAACAATGGACTTTTT
‑3’
或
[0030]5’‑
AATTAAAAAGTCCATTGTTCGTGTCTTGACCTCGAGGTCAAGACACGAACAATGGAC
‑3’
转录后
的shRNA碱基序列如SEQ ID No.1所示，即：5
’‑
CCGG本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种针对ARPC5基因、抑制肿瘤增殖和转移的shRNA，其特征在于，其碱基序列如SEQ ID No.1所示，即：5
’‑
CCGGGUCCAUUGUUCGUGUCUUGACCUCGAGGUCAAGACACGAACAATGGACUUUUU
‑3’
。2.根据权利要求1所述的shRNA，其特征在于：其针对的靶序列如SEQ ID No.2所示，即GUCCAUUGUUCGUGUCUUGAC。3.根据权利要求1或2所述的shRNA，其特征在于：该shRNA通过如SEQ ID No.3或4所示的DNA寡核苷酸链转录生成，即5
’‑

【专利技术属性】
技术研发人员：南刚，
申请(专利权)人：中国人民解放军空军军医大学，
类型：发明
国别省市：