MdWRKY54基因在调控植物响应低温胁迫中的应用制造技术

本发明专利技术提供了MdWRKY54基因在调控植物响应低温胁迫中的应用。本发明专利技术通过实验证明了MdWRKY54基因的过表达显著增加了低温胁迫下转基因苹果

【技术实现步骤摘要】
MdWRKY54基因在调控植物响应低温胁迫中的应用


[0001]本专利技术属于植物基因工程
，特别涉及MdWRKY54基因在调控植物响应低温胁迫中的应用。

技术介绍

[0002]低温影响植物的生长发育与地理纬度分布，低温灾害是造成作物减产的主要逆境之一。低温胁迫分为冷害(0
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15℃)和冻害(<0℃)，可导致组织损伤甚至植物死亡。在苹果的生长发育过程中，温度的适度变化有利于诱导植株的生长发育，过高和过低的温度都会影响这个过程，可能对其造成不可逆转的损伤，甚至导致果树死亡，进而影响苹果的产量与品质。
[0003]WRKY转录因子家族是植物中最大的转录因子家族之一，其最主要的结构特点是在N端具有保守的WRKY DNA结合结构域，该结构域是一段大约由60个高度保守的氨基酸残基所组成的多肽序列,其中WRKYGQK为在所有成员中绝对保守的7个氨基酸残基，其C端具有保守的锌指结构。大量的研究显示WRKY转录因子与顺式作用元W
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box[(T)(T)TGAC(C/T)]特异性结合，TGAC序列是W
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box的核心，任何一个碱基的变化都将导致其与WRKY结构域的结合能力的削弱甚至消失。近年来研究表明WRKY转录因子在植物的生长发育、调控开花时间、花青苷和原花青苷生物合成、种子发育、毛状体发育、叶片衰老、生物和非生物胁迫等诸多方面起着重要作用。

技术实现思路

[0004]本专利技术提供了MdWRKY54基因在调控植物响应低温胁迫中的应用。本专利技术将MdWRKY54的全长CDS连接到带有35S启动子的表达载体上，利用农杆菌侵染转化杨树和苹果，证明该基因的过表达可以提高植物的耐寒性。本专利技术通过实验阐明MdWRKY54参与苹果响应低温胁迫的分子机制，为培育抗寒苹果砧木新材料提供基因储备和理论指导。
[0005]为实现上述专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案予以实现：
[0006]本专利技术提供了MdWRKY54基因在调控植物响应低温胁迫中的应用。
[0007]进一步的：所述MdWRKY54基因的CDS核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0008]进一步的：所述低温胁迫包括温度为0～15℃的低温冷害和<0℃的低温冻害。
[0009]进一步的：低温胁迫处理后转基因愈伤组织的鲜重显著高于野生型愈伤组织，且转基因愈伤组织的离子渗透率低于野生型愈伤组织。
[0010]进一步的：低温胁迫处理后的转基因株系的存活率显著高于野生型，离子渗透率低于野生型，且MDA含量也显著低于野生型。
[0011]进一步的：低温胁迫处理后转基因株系积累的活性氧少于野生型，抗寒性强于野生型。
[0012]进一步的：MdWRKY54过表达转基因株系中的MdCBF1、MdCBF2、MdCBF4和MdCBF5基因的表达量显著高于野生型。
[0013]进一步的：所述MdWRKY54基因增强MdCBF1、MdCBF4和MdCBF5启动子活性，正向调控MdCBF1、MdCBF4和MdCBF5的表达。
[0014]进一步的：所述MdWRKY54基因能通过直接结合MdCBF1、MdCBF4和MdCBF5启动子的W
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box[(T)(T)TGAC(C/T)]元件上调苹果响应低温胁迫特征基因MdCBFs的表达。
[0015]进一步的：所述植物包括杨树和苹果。
[0016]与现有技术相比，本专利技术的优点和有益效果：本专利技术从俄罗斯砧木从中分离和克隆到MdWRKY54基因，利用现有的植物基因工程技术获得重组过表达载体，再利用农杆菌介导的转化法转化
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杨树和苹果愈伤组织，经组织培养与鉴定筛选，获得了纯合的过表达MdWRKY54基因的
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杨树和转基因
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王林
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愈伤组织。将其与相同条件下生长的野生型植株进行比较，过表达MdWRKY54基因的
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杨树和苹果表现出更强的耐寒性表型，并参与调控与抗寒相关基因的表达，因此经过本专利技术的实验证明，所述MdWRKY54基因可以应用于培育抗寒品种，具有很高的农业应用价值。
附图说明
[0017]图1是苹果基因MdWRKY54编码的氨基酸与白杨、拟南芥、水稻、烟草以及赤豆中WRKY54蛋白构建的进化树。
[0018]图2是PCR扩增MdWRKY54基因检测的电泳条带。
[0019]图3是转基因
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王林
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愈伤组织的筛选鉴定；A:pCAMBIA2300
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GFP
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MdWRKY54转基因愈伤DNA水平上的鉴定；B：pCAMBIA2300
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GFP
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MdWRKY54转基因愈伤RNA水平上的鉴定。
[0020]图4是MdWRKY54增强
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王林
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愈伤组织的抗寒性；其中A：低温处理前后过表达MdWRKY54转基因愈伤的表型图；B：低温处理前后
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王林
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愈伤组织的鲜重图；C：低温处理后NBT染色变化图；D：低温处理后离子渗透率变化图。
[0021]图5是转基因
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杨树的筛选鉴定及抗寒性分析A：pCAMBIA2300
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GFP
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MdWRKY54转基因杨树RNA水平上的鉴定；B：离子渗透率变化图；C：存活率统计图；D：MDA含量变化图；E、F：冻害处理MdWRKY54过表达转基因杨树后的表型图；G：NBT组织化学染色。
[0022]图6是响应低温胁迫特征基因在MdWRKY54过表达转基因愈伤组织中的表达量。
[0023]图7是酵母单杂交验证互作。
[0024]图8是MdWRKY54直接结合MdCBF1和MdCBF4启动子。
[0025]图9是MdWRKY54上调苹果响应低温胁迫特征基因MdCBFs的表达；A:MdWRKY54增强MdCBF1启动子活性；B:MdWRKY54增强MdCBF4启动子活性；C:MdWRKY54增强MdCBF5启动子活性。
具体实施方式
[0026]下面结合附图和具体实施例来对本专利技术的技术方案做进一步详细的说明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件；所用试剂材料如未具体说明，均为市售产品。
[0027]实施例1：苹果基因MdWRKY54的序列分析、克隆与载体构建
[0028]一、苹果基因MdWRKY54基因的获取
[0029]利用苹果基因组数据库网站GDR找到基因MD04G1167700，命名为MdWRKY54，
MdWRKY54的CDS序列如SEQ ID NO.1所示，长度为1本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.MdWRKY54基因在调控植物响应低温胁迫中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述MdWRKY54基因的CDS核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述低温胁迫包括温度为0～15℃的低温冷害和<0℃的低温冻害。4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，低温胁迫处理后转基因愈伤组织的鲜重显著高于野生型愈伤组织，且转基因愈伤组织的离子渗透率低于野生型愈伤组织。5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，低温胁迫处理后的转基因株系的存活率显著高于野生型，离子渗透率低于野生型，且MDA含量也显著低于野生型。6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，低温胁迫处理后转基因株系积累的活性氧少于野生型，抗寒性强于...

【专利技术属性】
技术研发人员：侯鸿敏，陈果，刘雪莉，张玉刚，姜生辉，孙晓红，柏素花，徐吉花，董超华，
申请(专利权)人：青岛农业大学，
类型：发明
国别省市：