本申请属于生物医药领域，涉及一种重组VAR2CSA，其可以对肿瘤型硫酸软骨素(ofCS)及其修饰的蛋白聚糖(ofCSPG)的特定分型进行检测。本申请的重组VAR2CSA与硫酸软骨素A(CSA)有较高的结合亲和力，以本申请的重组VAR2CSA所构建的肿瘤型硫酸软骨素及其修饰的蛋白聚糖检测方法，对所有表达CSA的恶性肿瘤均具备检出效果。基于本申请的重组VAR2CSA的肿瘤型硫酸软骨素及其修饰的蛋白聚糖检测方法可用于肿瘤的早期筛查、诊断、肿瘤负荷监测及预后预测。预测。预测。
【技术实现步骤摘要】
一种重组VAR2CSA及其在肿瘤型硫酸软骨素蛋白聚糖检测中的应用
[0001]本专利技术属于生物医药领域，涉及一种重组VAR2CSA及其在肿瘤型硫酸软骨素和/或肿瘤型硫酸软骨素修饰的蛋白聚糖检测中的应用。
技术介绍
[0002]体液作为人体重要的组成部分，因其具备无创取材的优点，使得液体活检成为肿瘤标志物的主要应用领域。目前已有许多具有肿瘤筛查诊断价值的无创活检方式，如：循环肿瘤细胞(CTCs)1、循环肿瘤DNA(ctDNA)2、外泌体3等；一些泛癌种的肿瘤标志物也逐渐被发现，如GRAIL公司开展的基于外周血cfDNA甲基化的泛癌筛查标志物可检出并定位肿瘤发生部位4。尽管如此，上述方法在检测灵敏度、特异度、检测费用方面仍然存在着局限性，亟待开发更优良的标志物。
[0003]蛋白质作为生命中重要的生物大分子，参与细胞能量储存、代谢到细胞功能调节，是体液中与疾病进展直接相关的靶标5。蛋白质的糖基化是最常见且最复杂的翻译后修饰方式之一，常见的糖基化修饰包括N
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连接的糖基化(N
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linked glycosylation)，O
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连接的糖基化(O
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linked glycosylation)等。糖基化改变是恶性肿瘤发生发展过程中不可或缺的环节，肿瘤中异常表达的糖蛋白已被用于开发常见的恶性肿瘤标志物，如甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)等8。尽管如此，这些糖蛋白类的肿瘤标志物检测效能有限、仅适用于特定肿瘤类型、且在早期肿瘤中含量少，目前仅在晚期肿瘤的诊断及预后监测中得以应用。
[0004]糖胺聚糖(Glycosaminoglycan，GAG)是细胞外基质中重要的糖基化类型。GAG是一种大型线性多糖，由重复的二糖单元组成，根据不同位置的硫酸化程度不同分为不同亚型。硫酸软骨素(Chondroitin sulfate，CS)是第二大类异构的GAG亚型，以共价的形式结合细胞外基质、细胞内和细胞外环境中的蛋白质，形成硫酸软骨素蛋白聚糖(Chondroitin sulfate proteoglycans，CSPGs)，在功能上与多种配体相互作用，调节许多生理和病理过程
6,7,9
。恶性肿瘤细胞中普遍存在着一种特殊结构的硫酸软骨素修饰，称为肿瘤型硫酸软骨素(oncofetal chondroitin sulfate,ofCS)，或胎盘样硫酸软骨素(placental chondroitin sulfate,plCS)
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。该结构的主要特征为90％左右的N
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乙酰半乳糖胺残基的C4单一位点发生硫酸化，而存在于正常细胞外基质及细胞膜表面的CS糖胺聚糖则在N
‑
乙酰半乳糖胺残基的4位或6位发生不同程度的硫酸化
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。重要的是，该硫酸软骨素可被疟原虫感染的红细胞特异表达的VAR2CSA蛋白结合。VAR2CSA是在恶性疟原虫(P.falciparum)感染的红细胞表面表达的大型多结构域蛋白(350kDa)，其胞外段结构域可以高亲和力结合ofCS
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。基于该特性，VAR2CSA蛋白开始被探索用于开发靶向硫酸软骨素聚糖异常表达疾病的药物、从肿瘤患者血液中分离循环肿瘤细胞
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以及从膀胱癌患者的尿液中检测ofCS修饰的蛋白多糖
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，但研究结果还非常初步。
[0005]已有研究通过表达一段28个氨基酸的VAR2CSA短肽，构建以VAR2CSA短肽为捕获分子，抗ofCS的抗体为检测分子的ELISA检测体系
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。但是该方法所使用的VAR2CSA短肽对人体
肿瘤细胞及其分泌在体液中的肿瘤型硫酸软骨素的亲和力不详，存在着检测灵敏度低(对早期肿瘤检测效果不详)、尚需要大样本的人群队列加以证明其可靠性，以及ofCS抗体制备难度大等缺点(授权公告号：CN 109387627 B)。在公开的相关专利技术中(申请公布号：CN 113740521 A)，还有通过rVAR2检测肾癌和膀胱癌患者尿液中的游离ofCS水平用以诊断癌症，然而该方法所用的ELISA为直接法，不能检测具体的肿瘤型硫酸软骨素修饰的分子类型/亚型，灵敏度低，检测效果同样仍需要大样本数据支持。
[0006]Var2csa基因具有高度的可变性，其遗传多样性可能会影响结合效果。此外，VAR2CSA在细胞外区域包含6个Duffy
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Binding
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Like(DBL)结构域。不同的研究表明，VAR2CSA的几个结构域(DBL2X、DBL3X、DBL5ε和DBL6ε)可与CSA结合。VAR2CSA的全长胞外区域可确保特异性的、高亲和力的与CSA结合，但其最小CS结合区域可由DBL2X结构域和侧翼结构域间(ID)区域组成
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。通过构建不同序列和不同CS结合结构域的重组VAR2CSA，筛选最佳ofCS结合的VAR2CSA，从而建立ofCS检测的泛癌种肿瘤标志物的意义巨大。
[0007]由于ofCS糖胺聚糖以共价结合的方式附着在多种蛋白上，如CD44、SDC1、CSPG4等分子上形成独特的肿瘤型硫酸软骨素修饰的蛋白聚糖(ofCSPG)，是否可以联合含不同序列、结构域的VAR2CSA蛋白和蛋白聚糖的蛋白核心构建可特异检测体液中特定ofCS修饰的蛋白聚糖亚型，以有效补充现有肿瘤标志物的不足，具有更深层次的意义。
技术实现思路
[0008]一方面，本申请提供了一种蛋白，包含：
[0009]VAR2CSA的ID1结构域，
[0010]VAR2CSA的DBL2X结构域，和
[0011]VAR2CSA的ID2a结构域。
[0012]在一些实施方案中，所述蛋白还包含VAR2CSA的DBL1X结构域、VAR2CSA的ID2b结构域中的一种或两种。
[0013]在一些实施方案中，所述蛋白依次连续包含VAR2CSA的ID1、DBL2X、ID2a、ID2b结构域。
[0014]在一些实施方案中，所述蛋白依次连续包含VAR2CSA的DBL1X、ID1、DBL2X、ID2a、ID2b结构域。
[0015]在一些实施方案中，所述VAR2CSA为疟原虫株3D7的VAR2CSA和/或疟原虫株FCR3的VAR2CSA。
[0016]在一些实施方案中，所述VAR2CSA为疟原虫株3D7的VAR2CSA(NCBI:XP_001350415.1)和/或疟原虫株FCR3的VAR2CSA(GenBankNo:ADG23053.1)。
[0017]在一些实施方案中，所述蛋白通过重组表达系统进行表达；在一些实施方案中，所述重组表达系统包含真核表达系统和/或原核表达系统；在一些实施方案中，所述真核表达系统包括昆虫
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杆状病毒、哺乳动物细胞、酵母细胞中的一种或多种；在一些实施方案中，所述昆虫表达系统包括sf9细胞和pFastBac1质粒；在一些实施方案中，所述哺乳动物本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种蛋白，其特征在于，包含：VAR2CSA的ID1结构域，VAR2CSA的DBL2X结构域，和VAR2CSA的ID2a结构域。2.如权利要求1所述的蛋白，其特征在于，所述蛋白还包含VAR2CSA的DBL1X结构域、VAR2CSA的ID2b结构域中的一种或两种；优选地，所述蛋白依次连续包含VAR2CSA的ID1、DBL2X、ID2a、ID2b结构域；优选地，所述蛋白依次连续包含VAR2CSA的DBL1X、ID1、DBL2X、ID2a、ID2b结构域。3.如权利要求1所述的蛋白，其特征在于，所述VAR2CSA为疟原虫株3D7的VAR2CSA和/或疟原虫株FCR3的VAR2CSA；优选地，所述蛋白通过重组表达系统进行表达；优选地，所述重组表达系统包含真核表达系统和/或原核表达系统；优选地，所述真核表达系统包括昆虫
‑
杆状病毒、哺乳动物细胞、酵母细胞中的一种或多种；优选地，所述昆虫
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杆状病毒系统包括Sf9细胞和pFastBac1质粒；优选地，所述哺乳动物细胞系统包括HEK 293细胞；优选地，所述原核表达系统包括大肠杆菌和pGEX
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4T2质粒。4.如权利要求1所述的蛋白，其特征在于，所述蛋白包含SEQ ID NO:1
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4中任一所述的氨基酸序列；优选地，所述蛋白选自SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4。5.一种权利要求1
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4任一所述的蛋白的抗体；优选地，所述抗体选自单克隆抗体、多克隆抗体、纳米抗体、Fab抗体、Fv抗体、单链抗体中的一种或多种。6.一种核酸，其编码权利要求1
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4任一所述的蛋白。7.一种载体，其包含如权利要求6所述的核酸；优选地，所述载体选自质粒、噬菌体、人工染色体、病毒中的一种或多种；优选地，所述载体选自质粒；优选地，所述质粒选自pFastBac1、pGEX
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4T2中的一种或多种。8.一种细胞，其包含如权利要求7所述的载体；优选地，所述细胞选自原核细胞和/或真核细胞；优选地，所述原核细胞选自大肠杆菌；优选地，所述真核细胞选自昆虫细胞、哺乳动物细胞；优选地，所述昆虫细胞选自草地夜蛾、Sf9、Sf21、赤眼蜂细...
【专利技术属性】
技术研发人员：贾卫华，张佩芬，吴梓依，张文彬，何永巧，穆权凯，
申请(专利权)人：中山大学肿瘤防治中心中山大学附属肿瘤医院，中山大学肿瘤研究所，
类型：发明
国别省市：
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