一种培养器皿处理方法及其应用技术

本发明专利技术提供了一种培养器皿处理方法及其应用。具体的，在培养器皿底部和/或壁部包被上一层与其紧密结合的海藻酸钠层，当培养器皿中加入了海藻酸钠

【技术实现步骤摘要】
一种培养器皿处理方法及其应用


[0001]本专利技术涉及生物
，具体涉及一种培养器皿处理方法及其应用。

技术介绍

[0002]类器官(organoid)是来源于多能干细胞(PSCs)或成体干细胞(ASCs)的3D多细胞体外组织结构。作为一个新兴发展的生物科学技术，目前已有多种方法构建多种组织的类器官，包括：肝脏、结肠、胃肠道、肾脏、肺、前列腺、胰腺等，它有别于传统的2D细胞培养，是将干细胞经过体外培养、定向分化后自主装为器官样结构的细胞群，现已在医学研究和药物筛选中得到了广泛的应用，为医疗产品的开发提供了很好的工具。
[0003]类器官培养是一种基于三维体外细胞培养系统，是一种与体内来源组织或器官高度相似的体外培养组织，因此，这需要更加接近人体或动物最真实的细胞生长环境。目前的技术中，通常类器官培养主要是将细胞与基质胶或水凝胶混合后加到培养器皿例如培养皿或培养孔的底部凝固成胶，然后加入培养基淹没并进行培养。关于类器官培养体系目前的研究方向主要是通过调整培养体系的成分，涉及到培养基、基质胶、水凝胶等多方面，其目的是让各类不同的细胞有一个更加天然的生长环境，并尽可能使细胞状态保持与在人体内生长的相似。其中，基质胶是指从富含胞外基质蛋白EHS小鼠肿瘤中提取的可溶性基底膜制备物，其组分较为复杂，包括了多种蛋白、多糖及生长因子，能很好的模拟体内细胞基底膜的结构、组成、物理性质和功能。而水凝胶尽管不似基质胶的成分那么贴近天然状态，但它是某些应用的最佳选择，化学成分明确的水凝胶可通过对生长因子等作为培养基成分的有无及其浓度来判断实验条件的有效性，有效验证并提高某些实验的重现性。
[0004]尽管上述技术在近年来得到了飞速的发展，但仍属于起步阶段，面临了一系列需要解决的问题。在实际的培养过程中，实验表现出很多不确定性，例如在相同培养体系的组分条件下，随着培养时间的延长各培养器皿中的细胞或类器官的生长仍出现了较大的差异性，从而导致实验结果的不确定性。

技术实现思路

[0005]通过对类器官培养实验过程的反复观察与大量的实验论证，本专利技术意外的发现一种培养器皿处理方法可以有效的提高采用海藻酸钠水凝胶的类器官培养体系中细胞或类器官的生长状态。
[0006]本专利技术的第一方面提供了一种培养器皿处理方法，其包括：对海藻酸钠进行改性活化其羧基，将羧基化的海藻酸钠加入到底部和/或壁部标记有氨基的培养器皿中，通过形成羧基
‑
氨基交联结构使得改性后的海藻酸钠与培养器皿底部和/或壁部连接。
[0007]在本申请的一种具体实施方式中，具体采用碳二亚胺(EDC)和N
‑
羟基琥珀酰亚胺(NHS)对海藻酸钠进行改性(活化其羧基)。
[0008]本申请的第二方面提供了一种培养器皿，该培养器皿的底部和/或壁部通过羧基
‑
氨基交联包被有海藻酸钠层。
[0009]本申请的第三方面提供了一种类器官培养方法，采用上述第二方面提供的培养器皿进行类器官培养。
[0010]在本申请的一种具体实施方式中，将海藻酸钠和细胞的混合液加入到包被有海藻酸钠层的培养器皿中，待混合液凝固成胶后，再加入培养基进行培养。
[0011]采用本专利技术提供的培养器皿处理方法，使得培养器皿底部和/或壁部包被上一层与其紧密结合的海藻酸钠层。当培养器皿中加入了海藻酸钠
‑
细胞混合液后，在混合液中钙离子的作用下，混合液中靠近底部或壁部的海藻酸钠在凝固过程中和交联在培养器皿上的海藻酸钠层融合形成凝胶结构，增强了水凝胶
‑
细胞混合物的贴壁效果，此时器皿中的凝胶不会随培养时间的延长而出现从培养器皿的底部和/或壁部脱落悬浮的情况，显著地提高了细胞或类器官生长状态，同时，也显著地提高了显微镜成像等方法对细胞或类器官的状态进行观察和检测的稳定性，有利于细胞或类器官的长期生长的同时，也为长时间的跟踪观察提供了有力的支持，极大地改善了实验的稳定性和可重复性。
附图说明
[0012]图1为本专利技术培养器皿处理(生物偶联)原理示意图；
[0013]图2为本专利技术的实施例中采用本专利技术的培养器皿(包被有海藻酸钠层)的类器官长期培养状态图；
[0014]图3为本专利技术的实施例中采用传统培养器皿(未包被海藻酸钠层)的类器官长期培养状态图(对比例)。
具体实施方式
[0015]类器官培养与传统的2D细胞培养不同，三维(3D)细胞培养重现了细胞的体内环境，即使是简单的球体模型也能弥补单层培养的诸多缺陷。这一结构的差异可造成微环境中代谢物、营养物质、氧气等差异，产生多样化的细胞群。关于类器官培养很多都依赖于生物基质胶，但这类基质胶的成分复杂，增加了对类器官生长发育研究的复杂性，于是高分子水凝胶作为替代进入了研究领域，海藻酸钠就是其中之一。
[0016]海藻酸钠是一种多糖，结构上具有大量的羧基基团，其分子由β
‑
D
‑
甘露糖醛酸(M单元)和α
‑
L
‑
古洛糖醛酸(G单元)按(1
→
4)键连接而成，当有二价阳离子如钙离子存在时，其G单元上的钠离子与钙离子发生离子交换反应，快速形成G单元交联网络，形成水凝胶，非常适合用于细胞的三维培养基质材料。但在实际研究过程中，即使采用相同的海藻酸钠水凝胶培养体系，随着培养时间的延长，细胞生长状态并未表现出稳定的一致性。经过研究和实验比对，本专利技术发现海藻酸钠水凝胶贴壁不牢、培养过程中容易漂浮是造成细胞和类器官生长不良的重要原因。尤其随着培养时间增长，海藻酸钠水凝胶在培养器皿中漂浮造成了细胞生长速度和状态的变化，甚至死亡。同时，这样的脱落漂浮还带来了实验结果的观察检测的不稳定性以及难以高通量等不足。
[0017]为解决上述问题，本专利技术创造性地发现通过对培养器皿表面进行生物偶联处理，即通过形成羧基
‑
氨基交联结构在培养器皿的底部和/或壁部紧密结合海藻酸钠层，再加入细胞和海藻酸钠混合物凝固形成凝胶，此时，在混合液中钙离子的作用下，海藻酸钠
‑
细胞混合液靠近底部或壁部的海藻酸钠在凝固过程中和交联在培养器皿上的海藻酸钠层融合
形成凝胶结构，大大提高了水凝胶的贴壁特性，使得培养器皿中的整体凝胶结构与培养器皿形成稳定的紧密结合。经过反复实验证明，这一改良整体提高了同批次实验的稳定性，具有极强的实用效果。
[0018]上述培养器皿处理方法适用于各种培养容器，包括且不限于培养皿、多孔板、培养板等，对培养器皿的材质也没有特殊要求。关于细胞培养器皿的表面修饰技术(标记氨基)可通过现有技术进行，也可通过购买的方式得到修饰了特定化学基团的培养皿，比如本申请的一种具体实施方式中，采用的培养皿是康宁公司的产品，该培养皿表面具有氨基修饰，其他试剂耗材供应商也提供带有化学基团修饰的聚苯乙烯(PS)培养板。
[0019]尽管海藻酸钠本身含有大量的羧基基团，但其羧基需经活化后才可与培养器皿表面的氨基反应形成稳定且牢本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种培养器皿处理方法，其特征在于，所述处理方法包括对海藻酸钠进行改性活化其羧基，将羧基化的海藻酸钠加入到底部和/或壁部标记有氨基的培养器皿中，通过形成羧基
‑
氨基交联结构在培养器皿底部和/或壁部包被海藻酸钠层。2.如权利要求1所述的处理方法，其特征在于，采用碳二亚胺和N
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羟基琥珀酰亚胺对海藻酸钠进行改性。3.如权利要求1所述的处理方法，其特征在于，包括以下步骤：1)用2
‑
(N
‑
吗啉代)乙磺酸(MES)缓冲液配制海藻酸钠溶液；2)在步骤1)的海藻酸钠溶液中加入碳二亚胺混合；再将N
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羟基琥珀酰亚胺加入海藻酸钠与碳二亚胺的混合液中充分混合均匀；将海藻酸钠/碳二亚胺/N
‑
羟基琥珀酰亚胺混合液放置于转盘上，旋转活化；3)步骤2)中所述混合液加入氨基标记的培养器皿中，将培养器皿放置于转盘上，旋转反应；4)吸去步骤3)处理后的培养器皿中的液体，用磷酸盐缓冲液清洗若干遍；再用超纯水清洗培养器皿若干遍，直接使用或待培养器皿干燥后保存备用。4.如权利要求3所述的处理方法，其特征在于，所述步骤1)中的海藻酸钠溶...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵远波，吕佩涛，谢利雄，
申请(专利权)人：深圳欧玛生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：