一种海洋生物活性肽的制备方法技术

本发明专利技术本发明专利技术属于海洋生物加工技术领域，具体涉及一种海洋生物活性肽的制备方法。步骤如下：海胆黄清洗，粉碎均质成糜；将上述糜碱提酸沉提取蛋白质沉淀；重悬，用木瓜蛋白酶酶解；用膜分子截流分子量小于3kDa的组分；用凝胶柱分离出能修复细胞紫外损伤的组分；用反相高效液相进行分离纯化，冷冻干燥，得到活性肽。本发明专利技术制备得到的海胆黄活性肽对UVB损伤的HaCaT细胞活性修复效果明显；本发明专利技术制备得到的海胆黄活性肽能有效降低小鼠紫外照射模型血清中8

【技术实现步骤摘要】
一种海洋生物活性肽的制备方法


[0001]本专利技术本专利技术属于海洋生物加工
，具体涉及一种海洋生物活性肽的制备方法。

技术介绍

[0002]海胆是一类海洋无脊椎动物，属于棘皮动物门(Ech i nodermata)下的一个类群。它们在世界各大洋的海底中广泛分布，包括浅海和深海区域。海胆的身体通常呈圆球形或半球形，表面覆盖着坚硬的棘刺，这些棘刺可以通过肌肉的收缩和舒张进行运动。
[0003]海胆是海鲜中不可多得的珍品之一，它的食用部分为其生殖腺和卵粒，色泽橙黄如小米，颗粒分明，俗称海胆黄，又称海胆籽、海胆卵、海胆膏，约占海胆全重的10
‑
20％。海胆黄鲜味独特，深受国人民的喜爱。海胆除了其食用价值外，其还具有较高的药用价值。海胆棘壳色素具有明显的抗肿瘤、抗氧化、抗菌及保护心血管等生理活性，俄罗斯甚至将海胆棘壳色素作为治疗心血管疾病的药物进入临床应用。海胆黄含有大量的蛋白质、多不饱和脂肪酸、糖类和其他生理活性物质，2006年，刘纯慧等从光棘球海胆生殖腺中分离得到海胆黄多糖，检测其分子量为1.95
×
106Da，具有明显的抗肿瘤活性。
[0004]目前已有研究表明，海胆具有独特的紫外防护机制，但具体的活性成分尚不明确，本专利技术旨在提取具有紫外防护蛋白类活性成分，研究其结构，提供能有效预防皮肤晒伤，还能有效促进晒伤皮肤修复生物活性肽。

技术实现思路

[0005]为实现上述目的，本专利技术提供了一种海洋生物活性肽的制备方法，其包括以下步骤：
>[0006]1)将海胆黄清洗，粉碎均质成糜；
[0007]2)在上述糜中加入超纯水制成溶液，料液比为1:5
‑
10w/v，加入NaOH溶液，调节适当的ph，静置提取2
‑
4h，使用酸逐滴调节溶液的pH至酸性，将析出的蛋白质沉淀收集；
[0008]3)将收集到的蛋白质重新溶解，加入木瓜蛋白酶，在适宜温度下酶解6
‑
12h；
[0009]4)将上述酶解液采用膜分子截流量为3kDa的Biomax改良的聚醚砜复合膜包进行超滤处理，分离纯化出A1(>3kDa)、A2(<3kDa)2种分子量的多肽溶液；
[0010]5)将A2多肽溶液脱盐，经Sephadex G
‑
25凝胶柱分离纯化，收集各峰，冻干后测定各组对于UVB损伤的HaCaT细胞活性的影响；
[0011]6)对上述UVB损伤修复效果最好的组分中加超纯水配制成溶液，经滤膜过滤后用反相高效液相进行分离纯化，收集洗脱峰；
[0012]7)将上述洗脱峰的组分离心，取上清液，冷冻干燥，得到活性肽。
[0013]优选地，所述料液比为1:6w/v。
[0014]优选地，加入NaOH溶液后，调节pH为8
‑
9.5。
[0015]优选地，所述酸为盐酸，滴加调节pH为4
‑
6。
[0016]优选地，所述木瓜蛋白酶的添加量为每克底物2000U
‑
4000U，所述酶解温度为38
‑
45℃，酶解时间为8
‑
10h。
[0017]优选地，所述凝胶柱的流动相为蒸馏水，流速为10ml/mi n。
[0018]优选地，所述反相高效液相色谱的色谱条件为：采用C
18
色谱柱4.6
×
250mm5μm，A相为含0.1％三氟乙酸的乙腈，B相为含0.1％三氟乙酸的超纯水，柱温25℃，流速1.0mL
·
mi n
‑1，洗脱过程为：0％～100％B洗脱8mi n，15％～85％B洗脱17mi n，30％～70％B洗脱10mi n，0％～100％B洗脱5mi n。
[0019]在本专利技术的较佳实施方式中，本专利技术提供了一种活性肽。
[0020]在本专利技术的另一较佳实施方式中，本专利技术提供了所述活性肽制备抗紫外损伤制剂中的应用。
[0021]在本专利技术的再一较佳实施方式中，本专利技术提供了一种化妆品，其包含所述活性肽。
[0022]本专利技术的技术方案具有如下效果：
[0023]1、本专利技术制备得到的海胆黄活性肽对UVB损伤的HaCaT细胞活性修复效果明显；
[0024]2、本专利技术制备得到的海胆黄活性肽能有效降低小鼠紫外照射模型血清中8
‑
OHdG含量，并增加皮肤组织过氧化氢酶的活性。
[0025]以下将结合附图对本专利技术的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本专利技术的目的、特征和效果。
附图说明
[0026]图1为本专利技术实施例2中B4组分对UVB照射HaCaT细胞活性的影响；
[0027]图2为本专利技术实施例2中B4组分的反相高效液相分离图谱；
[0028]图3为本专利技术实施例2中B4组分对UVB照射BALB/c小鼠抗氧化酶活性及DNA的影响，图A为小鼠紫外损伤模型血清中DNA损伤产物8
‑
OHdG含量；图B为小鼠紫外损伤模型皮肤组织过氧化氢酶CAT活性。
具体实施方式
[0029]以下参考说明书附图介绍本专利技术的多个优选实施例，使其
技术实现思路
更加清楚和便于理解。本专利技术可以通过许多不同形式的实施例来得以体现，本专利技术的保护范围并非仅限于文中提到的实施例。
[0030]试剂：木瓜蛋白酶，购于广西南宁庞博生物工程有限公司；色谱柱填料SephadexG
‑
15(美国Sigma公司)。
[0031]实施例1
[0032]将海胆黄清洗用自来水清洗，用刀式混合研磨仪粉碎并均质化制成糜，备用；
[0033]在上述糜中加入超纯水制成溶液，料液比为1:5
‑
10w/v，加入10mol/ml NaOH溶液，调节ph为9，静置提取3.5h，使用盐酸逐滴调节溶液的pH至4.4
‑
5.4，将析出的蛋白质沉淀收集；
[0034]调节木瓜蛋白酶酶解液的pH为8.5，加入木瓜蛋白酶，所述碱性蛋白酶的添加量为每克底物2000U
‑
4000U，所述酶解温度为41℃，酶解时间为8.5h；
[0035]将上述酶解液采用膜分子截流量为3kDa的Biomax改良的聚醚砜复合膜包进行超
滤处理，分离纯化出A1(>3kDa)、A2(<3kDa)2种分子量的多肽溶液，收集A2组分并用透析袋(100Da)进行除盐，经旋转蒸发浓缩后进行冷冻干燥，储存在
‑
20℃冰箱中备用。
[0036]实施例2
[0037]将A2多肽溶液脱盐，经HiTrap
TM
Desalting预装柱脱盐后，经Sephadex G
‑
25凝胶柱分离纯化，收集各峰，冻干后测定各组，其中凝胶柱分离纯化中洗脱液为超纯水，流速为10mL
·
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种海洋生物活性肽的制备方法，其包括以下步骤：1)将海胆黄清洗，粉碎均质成糜；2)在上述糜中加入超纯水制成溶液，料液比为1:5
‑
10w/v，加入NaOH溶液，调节适当的ph，静置提取2
‑
4h，使用酸逐滴调节溶液的pH至酸性，将析出的蛋白质沉淀收集；3)将收集到的蛋白质重新溶解，加入木瓜蛋白酶，在适宜温度下酶解6
‑
12h；4)将上述酶解液采用膜分子截流量为3kDa的Biomax改良的聚醚砜复合膜包进行超滤处理，分离纯化出A1(>3kDa)、A2(<3kDa)2种分子量的多肽溶液；5)将A2多肽溶液脱盐，经SephadexG
‑
25凝胶柱分离纯化，收集各峰，冻干后测定各组对于UVB损伤的HaCaT细胞活性的影响；6)对上述UVB损伤修复效果最好的组分中加超纯水配制成溶液，经滤膜过滤后用反相高效液相进行分离纯化，收集洗脱峰；7)将上述洗脱峰的组分离心，取上清液，冷冻干燥，得到活性肽。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述料液比为1:6w/v。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，加入NaOH溶液后，调节pH为8
‑
9...

【专利技术属性】
技术研发人员：王凡，
申请(专利权)人：王凡，
类型：发明
国别省市：