改进的高效特异性的纤维蛋白溶解酶纤溶酶的人Kunitz抑制剂制造技术

公开了与新的抑制纤溶酶的多肽相关的组合物和方法，这些抑制纤溶酶的多肽是人TFPI

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】改进的高效特异性的纤维蛋白溶解酶纤溶酶的人Kunitz抑制剂
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请根据35U.S.C.第119(e)节要求于2020年9月10日提交的共同未决美国临时专利申请系列号63/076,516和于2020年11月12日提交的共同未决美国临时专利申请系列号63/112,840的权益，这些申请通过引用整体并入本文。
[0003]关于在联邦政府资助的研究和开发下所作专利技术的权利的声明
[0004]本专利技术是在政府支持下完成的，资助号为HL141850，由美国国家卫生研究院授予。政府对本专利技术享有某些权利。


[0005]本专利
涉及能够抑制纤溶酶作用的多肽试剂。
[0006]专利技术背景
[0007]纤维蛋白溶解是一种生理过程，可调节凝块形成的程度及其在正常生理状况下的过度生长。然而，在外伤或外科手术、缺血和再灌注后，血液会接触到大的非内皮表面，如心肺旁路(CPB)回路，导致过度纤维蛋白溶解。此过度纤维蛋白溶解会导致凝血病、出血和炎症反应。在这些情况下，医务人员使用抑制纤溶酶(该过程的一种关键介质)的抗纤维蛋白溶解剂来减少出血、同种异体血液施用和不良的临床结果。
[0008]使用的抗纤维蛋白溶解剂是抑肽酶、氨甲环酸(TXA)和ε
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氨基己酸(EACA)。抑肽酶在2008年从市场上撤出，因为主要由于肾功能不全和过敏反应在患者中其产生的不良反应(1)。值得注意的是，鉴于其风险效益概况，抑肽酶已以限制使用的方式重新引入欧洲和加拿大(2)。然而，美国并未解除对抑肽酶的禁令。目前使用的赖氨酸类似物TXA和EACA不如抑肽酶有效，并且它们还会导致癫痫和肾功能不全(3，4)。蒙特利尔心脏外科小组最近发表的一篇文章(5)表明，2012年至2015年间，尽管几乎100％使用TXA，但在该中心接受心脏外科手术的所有患者中，近四分之一的患者输注了超过4个单位的红细胞。这导致作者得出结论，仍然需要一种有效的血液保护剂。所需的产品必须限定针对纤维蛋白溶解和炎症的蛋白酶抑制概况，该概况具有收益与风险的最佳平衡(6)。
[0009]近期，Ecallantide和MDCO
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2010这两款抑制纤溶酶的产品完成了心脏搭桥手术研究直至II期临床试验。然而，每种产品未能在III期心脏搭桥手术试验中提供令人满意的疗效和安全性概况，并且两项试验都被提前终止(7，8)。这可能与Ecallantide和MDCO
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2010是激肽释放酶的强抑制剂有关。此外，MDCO
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2010还抑制凝血蛋白酶因子Xa。另一种产品，Textilinin
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1，是一种来自蛇毒的Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂，其正处于开发的早期阶段(9)。在这种情况下，与来自牛肺的抑肽酶Kunitz结构域相比，上述Kunitz结构域来自蛇毒。因此，类似于抑肽酶，蛇毒Kunitz结构域预计会在人中产生过敏反应。抑肽酶的问题以及该
的技术人员为鉴定更适合体内使用的抗纤维蛋白溶解剂所做的持续努力表明，这是本领域公认的长期以来一直没有解决的问题，并且是本领域普通技术人员公认的持久需求。
[0010]探索用作抗纤维蛋白溶解剂的一组试剂包括人Kunitz型抑制剂多肽的变体(参见，例如美国专利号8,993，719和美国专利公开20080026998)。然而，由于这些人Kunitz型抑制剂多肽可以在体内与包括纤溶酶和丝氨酸蛋白酶如激肽释放酶的多种多肽相互作用，这类多肽的复杂药代动力学对发现具有一系列为此类变体多肽提供经优化在体内用作治疗剂的功能特性的氨基酸残基的人Kunitz型抑制剂变体多肽提出了挑战。

技术实现思路

[0011]如本文所公开的，已经制备了一种新的非天然存在的2型人组织因子途径抑制剂的Kunitz结构域1(KD1)的多肽变体，并发现它具有非常理想的药代动力学概况。例如，所公开的多肽具有药代动力学概况，其包括比抑肽酶(一种常规使用但有问题的抗纤维蛋白溶解剂)更好地抑制纤溶酶活性的能力。此外，除了这种新的多肽变体的纤溶酶抑制活性优于用抑肽酶观察到的纤溶酶抑制活性之外，本文公开的多肽变体进一步避免了用抑肽酶和相关分子观察到的某些不良副作用。在一个示例中，观察到本文公开的多肽变体对其他凝血丝氨酸蛋白酶如激肽释放酶表现出极小的抑制活性。
[0012]本文公开的60个残基多肽变体包括独特的一组氨基酸残基，包括含有赖氨酸残基的C端结构。不受特定理论或作用机制的束缚，该C端结构看起来促进60个残基多肽变体以抑制纤溶酶原结合纤维蛋白凝块的方式通过其Kringle结构域结合纤溶酶或纤溶酶原。本文公开的多肽变体还包括一组三个氨基酸突变(“KD1
Y11T/R15K/L17R
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K
T”)，其包括第15位的赖氨酸氨基酸取代。令人惊讶的是，观察到与仅具有双重突变Y11T/L17R的60个残基多肽变体相比，这种Y11T/R15K/L17R三重突变体抑制纤溶酶的效力高4至5倍。不受特定理论或作用机制的束缚，这种在第15位具有赖氨酸氨基酸取代的三重突变体看起来通过促进这种变体多肽与纤溶酶中的残基Asp189和Ser 190的相互作用来发挥作用。出乎意料的是，与可比较的仅具有双重突变Y11T/L17R的60个残基多肽变体相比，该60个残基Y11T/R15K/L17R三重突变多肽进一步表现出至少弱10倍的对激肽释放酶、因子XIa和因子VIIa/组织因子的抑制。因此，本文公开的60个残基变体多肽表现出非常理想的药代动力学/材料概况，包括例如强烈抑制纤溶酶的能力，同时避免与该技术中的类似抑制分子相关的某些副作用。
[0013]本文公开的专利技术具有多个实施方案。本专利技术的实施方案包括，例如包括包含以下序列的多肽的物质组合物：NAEICLLPLDTGPCKARLLRYYYDRYTQSCRQFLYGGCEGNANNFYTWEACDDACWRIEK(SEQ ID NO：1)和/或分离的非天然存在的多肽SEQ ID NO：1)。通常，此类物质组合物还包括额外的试剂，例如药学上可接受的载剂，如防腐剂、张力调节剂、去污剂、水凝胶、粘度调节剂、pH调节剂等。此类的实施方案包括，例如，药物组合物，其包括选择用于静脉内注射或输注的药学上可接受的赋形剂。
[0014]本专利技术的另一个实施方案是包括编码以下多肽序列的多核苷酸的物质组合物：NAEICLLPLDTGPCKARLLRYYYDRYTQSCRQFLYGGCEGNANNF YTWEACDDACWRIEK(SEQ ID NO：1)。在本文公开的本专利技术的工作实施方案中，该多核苷酸包含以下序列：AACGCGGAGATCTGTCTCCTGCCCCTAGACACCGGACCCTGCAAAGCCAGACTTCTCCGTTACTACTACGACAGGTACACGCAGAGCTGCCGCCAGTTCCTGTACGGGGGCTGCGAGGGCAACGCCAACAATTTCTACACCTGGGAGGCTTGCGACGAT本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.药物组合物，其包含：具有以下序列的多肽：NAEICLLPLDTGPCKARLLRYYYDRYTQSCRQFLYGGCEGNANNFYTWE ACDDACWRIEK(SEQ ID NO:1)；和药学上可接受的赋形剂。2.如权利要求1所述的组合物，其中所述药学上可接受的赋形剂选自防腐剂、张力调节剂、去污剂、水凝胶、粘度调节剂或pH调节剂中的至少一种。3.如权利要求2所述的组合物，其中所述组合物包含药学上可接受的组合物，所述药学上可接受的组合物包括选择用于静脉内注射或输注的药学上可接受的赋形剂。4.如权利要求1
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3中任一项所述的组合物，其中在包含0.1mg/mL的牛血清白蛋白(BSA)和2mM钙的tris缓冲盐水(TBS)中，在37℃孵育所述组合物至少2天、4天或1周后所述多肽的纤溶酶抑制常数(Ki)变化小于10％。5.组合物，其包含编码以下多肽序列的多核苷酸：NAEICLLPLDTGPCKARLLRYYYDRYTQSCRQFLYGGCEGNANNFYTWE ACDDACWRIEK(SEQ ID NO:1)。6.如权利要求5所述的组合物，其中所述多核苷酸包含以下序列：AACGCGGAGATCTGTCTCCTGCCCCTAGACACCGGACCCTGCAAAGCCAGACTTCTCCGTTACTACTACGACAGGTACACGCAGAGCTGCCGCCAGTTCCTGTACGGGGGCTGCGAGGGCAACGCCAACAATTTCTACACCTGGGAGGCTTGCGACGATGCTTGCTGGAGGATAGAAAAA(SEQ ID NO:2)。7.如权利要求6所述的组合物，其中所述多核苷酸放置于包含用于在细胞中表达所述多肽的一个或多个调控序列的载体中。8.细胞，其包含权利要求7所述的载体。9.如权利要求7所述的细胞，其中所述细胞是细菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞...

【专利技术属性】
技术研发人员：S，
申请(专利权)人：加利福尼亚大学董事会，
类型：发明
国别省市：