一种检测长枝木霉的LAMP引物组、试剂盒和检测方法技术

本发明专利技术公开了一种检测长枝木霉的LAMP引物组、试剂盒和检测方法，属于分子检测技术领域。本发明专利技术提供了一种检测长枝木霉的LAMP引物组，并基于所述LAMP引物组构建了LAMP检测试剂盒，所述LAMP引物组特异性强。本发明专利技术还提供了利用所述LAMP引物组或检测试剂盒进行长枝木霉的检测方法，灵敏度高，检测限高达64fg/μL。本发明专利技术所述方法可直接检测菌棒的带菌情况，操作简单、成本低廉，适合普通实验室及田间大批量检测。本发明专利技术建立了长枝木霉的快速、简便、特异性强、灵敏度高而且可用肉眼观察的监测技术体系，可在农业生产中推广应用。可在农业生产中推广应用。可在农业生产中推广应用。

【技术实现步骤摘要】
一种检测长枝木霉的LAMP引物组、试剂盒和检测方法


[0001]本专利技术属于分子检测
，具体涉及一种检测长枝木霉的LAMP引物组、试剂盒和检测方法。

技术介绍

[0002]在栽培过程中，由于食用菌菌棒污染导致减产甚至绝产的情况尤为严重，污染的菌棒如若处理不当，会造成循环污染，菇农连年受灾，不仅污染环境、浪费资源，更给菇农造成了巨大经济损失。在接种前导致菌棒污染的真菌病害中长枝木霉(Trichodermalongibrachiatum)尤为严重，因此建立长枝木霉菌快速检测体系，早期对被污染的食用菌菌棒进行快速准确检测，对预测病害发生情况、及时采取有效的防治措施控制病原菌爆发、及时处理、减少经济损失都具有重要的理论和实际意义。
[0003]目前对长枝木霉的检测大多仍沿用传统的组织分离培养及形态学鉴定方法，但是，这种鉴定方法耗时长，一般完成一次检测要一周以上，工作量大，并且分离成功率不高，有着很大的局限性。若所分离的病害样本不新鲜，则更难确诊病原菌，难以满足对菌棒污染诊断的实际需要，这对病原菌的检测和防控十分不利。随着核酸相关的鉴定方法不断发展，基于普通PCR的方法已经成功用于病原菌的检测，但PCR法特异性等检测耗时偏长，需要6～8h，同时PCR方法需要昂贵仪器PCR仪，检测过程较繁杂。且大多数PCR检测方法都是用病菌的培养物进行，前期需要进行病菌的分离、培养和纯化，无法进行现场检测，实际应用意义不大。
[0004]环介导等温扩增技术(Loop
‑
mediatedisothermalamplification，LAMP)因其扩操作简便、快速、特异性高、成本低等优点，成为可以替代PCR的新的核酸扩增技术，但是目前并没有关于检测长枝木霉的LAMP研究。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供一种检测长枝木霉的LAMP引物组、试剂盒和检测方法，引物特异性强，扩增效率高，可从食用菌菌棒中快速检测长枝木霉。
[0006]本专利技术提供了一种检测长枝木霉的LAMP引物组，包括核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的外引物上游引物，SEQ ID No.2所示的外引物下游引物，SEQ IDNo.3所示的内引物上游引物，SEQ ID No.4所示的内引物下游引物。
[0007]本专利技术提供了一种检测长枝木霉的LAMP试剂盒，包括上述LAMP引物组和LAMP反应液。
[0008]优选的，所述LAMP反应液包括10
×
ThermoPolBuffer、dNTPs、MgCl2、甜菜碱、BstDNA聚合酶和ddH2O。
[0009]优选的，所述LAMP试剂盒中还包括染料。
[0010]本专利技术还提供了一种检测长枝木霉的方法，包括以下步骤：以待测样品的基因组DNA为模板，与上述LAMP试剂盒中的试剂构建LAMP反应体系，进行LAMP反应，对反应结果进
行可视化鉴定。
[0011]优选的，所述LAMP反应体系中外引物上游引物和外引物下游引物的终浓度均为0.2μM，内引物上游引物和内引物下游引物的终浓度均为1.6μM。
[0012]优选的，所述LAMP反应体系以15μL计，包括：1.5μL10
×
ThermoPolBuffer、2.1μL1.4mMTPMix、1μL6mMMgSO4、各2.4μL1.6μMFIP/BIPPrimers、各0.6μL0.2μMF3/B3、0.6μL320U/mLBstDNAPolymeraseLargeFragment、2.4μL0.8MBetaine(5M)、0.6μL150μMHNB(3.75mM)、1μL模板DNA(100ng/μL)和余量的ddH2O。
[0013]优选的，所述LAMP反应包括在60℃反应60min。
[0014]优选的，所述可视化鉴定包括利用颜色变化进行鉴定，所述LAMP反应体系中还包括150μM羟基萘酚蓝；反应结束后，观察到天蓝色判断为阳性，即判定为含长枝木霉。
[0015]优选的，所述可视化鉴定包括琼脂糖凝胶电泳，琼脂糖凝胶电泳出现梯形条带判断为阳性，即判定为含长枝木霉。
[0016]有益效果：本专利技术提供了一种检测长枝木霉的LAMP引物组，并基于所述LAMP引物组构建了LAMP检测试剂盒，所述LAMP引物组特异性强，有样本中含有长枝木霉才能产生阳性结果，即便是针对相同属真菌中相对保守的基因，也能特异性识别长枝木霉。
[0017]本专利技术还提供了利用所述LAMP引物组或检测试剂盒进行长枝木霉的检测方法，通过倍比稀释长枝木霉基因组DNA进行灵敏度检测，LAMP技术可检测到最低长枝木霉真菌DNA浓度为64fg/μL，比常规PCR高出100倍，灵敏度高。本专利技术所述方法可直接检测菌棒的带菌情况，无需经过病菌的分离、培养，也无需对培养的病毒进行DNA提取程序；且成本低廉，无需昂贵仪器就能完成反应，适合普通实验室及田间大批量检测；反应结束后，可以肉眼直接观察反应结果，全部过程只需60min，大大缩短了检测时间。
附图说明
[0018]图1为本专利技术所述LAMP引物组的引物筛选结果图；
[0019]图2为本专利技术所述LAMP引物组的特异性鉴定结果图；
[0020]图3为反应温度对LAMP反应的影响结果图；
[0021]图4为反应时间对LAMP反应的影响结果图；
[0022]图5为LAMP反应的灵敏度结果图，图中B.LAMP反应产物的凝胶电泳；C.常规PCR产物的凝胶电泳；
[0023]图6为不同菌株的LAMP检测结果图，图中1～14分别表示长枝霉菌的不同菌株。
具体实施方式
[0024]本专利技术提供了一种检测长枝木霉的LAMP引物组，包括核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的外引物上游引物(F3：5
’‑
GTCCTTGATGTCGTCCGTC
‑3’
)，SEQ ID No.2所示的外引物下游引物(B3：5
’‑
ACGGTATCCGAGACCTTGG
‑3’
)，SEQ ID No.3所示的内引物上游引物(FIP：5
’‑
CACCACCCAGCGAGTGGGTAGCGAGGCCGAAAACTGTG
‑3’
)，SEQ IDNo.4所示的内引物下游引物(BIP：5
’‑
CGGTTCCGGTATGGGTACCCTGAAGGTGGCCATCATGCG
‑3’
)。
[0025]本专利技术优选根据食用菌菌棒中长枝木霉NPRS31基因的DNA序列设计上述特异性LAMP引物组，且所述引物组可特异性识别长枝木霉的NPRS31基因。本专利技术利用长枝木霉和
哈茨木霉(Trichodermaharzianum)中相对保守的基因Tubulin，进行LAMP反应，结果显示只有长枝木霉能被扩增出来，证实了所述LAMP引物组的特异性。
[0026]本专利技术提供了一种检本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测长枝木霉的LAMP引物组，其特征在于，包括核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的外引物上游引物，SEQ ID No.2所示的外引物下游引物，SEQ ID No.3所示的内引物上游引物，SEQ ID No.4所示的内引物下游引物。2.一种检测长枝木霉的LAMP试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述LAMP引物组和LAMP反应液。3.根据权利要求2所述LAMP试剂盒，其特征在于，所述LAMP反应液包括10
×
ThermoPolBuffer、dNTPs、MgCl2、甜菜碱、BstDNA聚合酶和ddH2O。4.根据权利要求2或3所述LAMP试剂盒，其特征在于，所述LAMP试剂盒中还包括染料。5.一种检测长枝木霉的方法，其特征在于，包括以下步骤：以待测样品的基因组DNA为模板，与权利要求2～4任一项所述LAMP试剂盒中的试剂构建LAMP反应体系，进行LAMP反应，对反应结果进行可视化鉴定。6.根据权利要求5所述方法，其特征在于，所述LAMP反应体系中外引物上游引物和外引物下游引物的终浓度均为0.2μM，内引物...

【专利技术属性】
技术研发人员：付春伶，朱姝蕊，张国宾，刘沁雨，
申请(专利权)人：丽水职业技术学院，
类型：发明
国别省市：