一种寡聚DNA抑制非特异性扩增的方法技术

本申请公开了一种寡聚DNA抑制背景DNA存在条件下非特异性扩增产物的方法，属于核酸扩增领域。针对现有技术中存在的“非特异性扩增严重影响核酸扩增的灵敏度和特异性，且现有抑制方法存在难以高效抑制、序列设计繁琐等”的问题，本申请的技术方案中，在核酸扩增时，加入带有5

【技术实现步骤摘要】
一种寡聚DNA抑制非特异性扩增的方法


[0001]本专利技术涉及一种寡聚DNA抑制非特异性扩增的方法，尤其涉及一种带有5
’‑
凸出端和短茎环结构的寡聚DNA抑制非特异性扩增的方法，属于核酸扩增领域。

技术介绍

[0002]聚合酶链反应(PCR)是一种分子诊断技术，已广泛用于生物学领域(Food Measure,2018,12,675
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682；Clinical Microbiology Reviews,2020,33,48；Curr.Fungal.Infect.Rep.,2019,13,260
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273)。在PCR扩增过程中，尤其是在高背景DNA条件下的核酸扩增，引物和非目的片段之间不可避免的会出现一些互补配对，极易导致非特异性扩增产物的产生。这些非特异性扩增严重影响核酸检测的灵敏度和特异性，因此，如何抑制非特性扩增的问题亟待解决。
[0003]近年来，研究者们采用热启动酶、聚合酶抗体修饰等方法来抑制非特异性扩增，防止样品制备过程中生成非特异性扩增，然而这些方法难以抑制PCR循环过程中产生的非特异性扩增；另外，有研究者采用Touch down、提高退火温度(Molecules,2015,20,6048
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6059；Nucleic Acids Research,2005,33,e180
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e180)等方法来抑制非特异性扩增。但是当引物浓度高时，这些方法仍难以有效抑制其生成；此外，Brownie等人开发了一种HAND(Nucleic Acids Research,1997,25,3235
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3241)系统抑制引物二聚体的方法，然而此方法需根据模板针对性的设计引物序列，过程繁琐；而使用Jong
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Yoon Chun等人开发的DPO(Nucleic Acids Research,2007,35,e40
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e40)技术抑制非特异扩增时，却未能起到较好的抑制效果；一些碱基修饰方法(Biology Methods and Protocols,2020,5,bpaa004；Biotechniques,2009,47,881
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882)也被用于抑制非特异性扩增，但是这些方法涉及修饰，价格昂贵。
[0004]综上，亟需开发一种高效、序列设计简单、普适性好的抑制非特异性扩增方法。

技术实现思路

[0005]针对现有技术中存在“非特异性扩增严重影响核酸扩增的灵敏度和特异性，且现有的抑制方法存在难以高效抑制、序列设计繁琐等”的问题，依据PCR反应动力学，本申请提出一种寡聚DNA抑制非特异性扩增的方法，在PCR反应体系中加入寡聚DNA。DNA聚合酶结合寡聚DNA的能力高于引物与非目标片段或一对引物结合DNA聚合酶的能力，因此能够有效抑制非特异性扩增，而不影响特异性扩增。
[0006]为解决上述技术问题，本专利技术采取的技术方案是，一种寡聚DNA抑制非特异性扩增的方法，
[0007]在核酸扩增中，加入带有5
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凸出端和短茎环结构的寡聚DNA，所述寡聚DNA为带有5
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凸出端和短茎环的结构；值得注意的是，5
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端凸出长度为5nt
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7nt，此时DNA聚合酶与该结构处于动态结合的状态，使得该结构难被聚合酶延伸。
[0008]所述核酸扩增为恒温扩增、PCR反应体系扩增中的一种。
[0009]PCR反应程序分为扩增阶段和熔解阶段。扩增阶段：95℃预变性3min；循环周期为95℃变性15s；58℃退火20s；72℃延伸20s(此步骤设置荧光采集)，一般持续30
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50个循环。熔解阶段：从60℃开始以0.2℃/s升温至95℃，同时采集荧光信号。
[0010]优化的，上述寡聚DNA抑制非特异性扩增的方法，带有5
’‑
凸出端和短茎环结构的寡聚DNA适用于各种核酸扩增方法，更适用于抑制高背景DNA存在条件下PCR反应体系中的非特异性扩增的生成。
[0011]优化的，上述寡聚DNA抑制非特异性扩增的方法，带有5
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凸出端和短茎环结构的寡聚DNA的茎部长度为6bp
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12bp，环部长度为3nt
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10nt，5
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凸出端长度为3nt
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10nt的寡聚DNA。上述的带有5
’‑
凸出端和短茎环结构的寡聚DNA能体现较好的抑制非特异性扩增的作用，强于仅含平末端茎环结构的寡聚DNA。
[0012]优化的，上述寡聚DNA抑制非特异性扩增的方法，带有5
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凸出端和短茎环结构的寡聚DNA为茎部长度为8bp
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10bp、环部长度为3nt
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6nt、5
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凸出端长度为5nt
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7nt的寡聚DNA。
[0013]优化的，上述寡聚DNA抑制非特异性扩增的方法，加入带有5
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凸出端和短茎环结构的寡聚DNA的浓度为10nM
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500nM。低浓度的寡聚DNA即可实现对于非特异性扩增的抑制。寡聚DNA浓度越高，抑制非特异性扩增的效果越好。
[0014]优化的，上述寡聚DNA抑制非特异性扩增的方法，为防止寡聚DNA对特异性扩增造成影响，加入带有5
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凸出端和短茎环结构的寡聚DNA的浓度为50nM
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200nM。
[0015]优化的，上述寡聚DNA抑制非特异性扩增的方法，在高背景DNA存在条件下的PCR反应体系中，对抑制引物与非目标片段结合产生的非特异性扩增时，和/或抑制引物二聚体时,加入带有5
’‑
凸出端和短茎环结构的寡聚DNA。
[0016]优化的，上述寡聚DNA抑制非特异性扩增的方法，带有5
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凸出端和短茎环结构的寡聚DNA的茎部长度为8bp
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10bp、环部长度为3nt
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6nt、5
’‑
凸出端长度为5nt
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7nt时，在55℃
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72℃退火温度下，对于非特异性扩增的抑制。
[0017]优化的，上述寡聚DNA抑制非特异性扩增的方法，在核酸扩增中，加入带有5
’‑
凸出端和短茎环结构的寡聚DNA，针对低模板浓度、高背景DNA浓度条件下非特异性扩增进行抑制。
[0018]本申请的有益效果为：
[0019]本申请的技术方案中，采用“寡聚DNA抑制非特异性扩增的方法”，依据PCR反应动力学，DNA聚合酶与引物、模板引物复合物、非目的片段引物复合物之间的结合存在平衡，DNA聚合酶倾向于结合到碱基完全互补配对的DNA双链上。当有寡聚DNA存在时，模板—引物复合物之间碱基互补数大致为20bp，而寡聚DNA自身的3
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种寡聚DNA抑制非特异性扩增的方法，其特征在于：非特异性扩增为背景DNA存在条件下产生的；所述寡聚DNA为带有5
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凸出端和短茎环的结构。2.根据权利要求1所述的寡聚DNA抑制非特异性扩增的方法，其特征在于：带有5
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凸出端和短茎环结构的寡聚DNA的茎部长度为6bp
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12bp，环部长度为3nt
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10nt，5
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凸出端长度为3nt
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10nt的寡聚DNA。3.根据权利要求2所述的寡聚DNA抑制非特异性扩增的方法，其特征在于：带有5
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凸出端和短茎环结构的寡聚DNA为茎部长度为8bp
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10bp、环部长度为3nt
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6nt、5
’‑
凸出端长度为5nt
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7nt的寡聚DNA。4.根据权利要求1所述的寡聚DNA抑制非特异性扩增的方法，其特征在于：加入带有5
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凸出端和短茎环结构的寡聚DNA的浓度为10nM
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500nM。5.根据权利要求4所述的寡聚DNA抑制非特异性扩增的方法，其特征在于：加入带有5
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凸出端和短茎环结构的寡聚DNA的浓度为50nM
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200nM。6.根据权利要求1所述的寡聚DN...

【专利技术属性】
技术研发人员：梁兴国，宋子婷，安然，胡坤灵，杜书涵，
申请(专利权)人：中国海洋大学，
类型：发明
国别省市：