细胞分泌分析的装置和方法制造方法及图纸

提供了用于鉴定包含表现出细胞外效应的效应细胞的细胞群的方法和装置。该方法包括在多个开放室中保留多个细胞群，每个细胞群任选地包含一种或多种效应细胞。每个开放室可以包括读出颗粒群，并且开放室存在于包括第一组件和任选的第二组件的装置的第一组件中。开放室的平均纵横比≥0.6，并且第一组件与第二组件形成可逆密封。该方法还包括在所述室内孵育多个细胞群或其子集以及一种或多种读出颗粒或其子集，分析细胞群中细胞外效应的存在，其中读出颗粒提供细胞外效应的直接或间接读出，以及基于分析步骤的结果确定多个细胞群中的一个或多个细胞群内的一种或多种细胞是否表现出细胞外效应。出细胞外效应。出细胞外效应。

【技术实现步骤摘要】
细胞分泌分析的装置和方法
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求于2016年3月17日提交的美国临时专利申请连续号62/309,663的优先权，将其公开内容通过引用整体并入。
[0003]专利技术背景
[0004]细胞是生命的基本单位，并且没有两个细胞是相同的。实际上，已经显示看似相同的克隆细胞群在群体内的细胞之间显示出表型差异。从细菌细胞到部分分化的细胞(例如成体干细胞和祖细胞)到高度分化的哺乳动物细胞(例如免疫细胞，如抗体分泌细胞(ASC))的所有生命水平均存在细胞差异。细胞状态、功能和应答的差异可以来自多种机制，包括不同的历史、不同的分化状态、表观遗传变化、细胞周期效应、随机变化、基因组序列差异、基因表达、蛋白表达和不同的细胞相互作用效应等。因此，开发用于分析单细胞特性的敏感工具令人非常感兴趣。
[0005]许多细胞类型分泌具有生物学功能的蛋白。例如，不同的免疫细胞分泌多种因子，包括通过细胞信号转导起作用的生长因子、促进免疫激活或抑制的细胞因子以及特异性识别病原体(包括病毒、细菌、细胞、蛋白、聚糖或其他外来激发)的抗体。抗体还可以识别作为抗癌应答或自身免疫病症的一部分的非外来抗原(自体抗原或自身抗原)。由此，测量细胞分泌的蛋白的量和/或细胞分泌的蛋白的特性(例如序列、结合伴侣)的能力令人非常感兴趣。理想的是，对个体细胞进行这样的测量，以使测量可以用于鉴定与相同环境或群体内的其他细胞相比任何给定细胞分泌的蛋白的特性的差异。例如，分析单一或少量ASC分泌的抗体可以提供在对大量群体进行相同分析时不可获得的关于个体细胞的信息(例如抗体结合特性、功能作用)。
[0006]颌类脊椎动物的适应性免疫系统能够产生多种不同的抗体。这种多样性通过多种机制产生，包括可变区基因的组合重组，以在最终表达为独特的抗体的重链和轻链基因中产生遗传编码的多样性。在人中，这种基因重组发生在B细胞发育期间，并且可以在个体中产生数十亿种不同的抗体。激发之后，表达识别激发的抗体的B细胞被激活并扩增以产生无性繁殖的相关的B细胞。在该扩增期间，体细胞超变和选择导致群体中一些抗体的亲和力提高。该过程的结果是表达多种不同抗体的多种多样的B细胞。这些B细胞成熟为继续将抗体分泌到介质中的浆细胞或者成熟为表达膜结合抗体的记忆B细胞。为了鉴定具有改善的特性(例如亲和力、功能活性)的群体中的抗体，应将个体抗体以及因此ASC作为个体细胞进行研究。
[0007]有效鉴定结合特定靶标的抗体和/或特定功能作用的能力对于产生用于研究、诊断和治疗开发的抗体令人非常感兴趣。具有最佳治疗特性的抗体，特别是靶向表面受体的抗体的发现仍然是药物开发中的严重瓶颈。在针对免疫的应答中，动物可以产生数百万种不同的单克隆抗体(mAb)。每种mAb由称为抗体分泌细胞(ASC)的单一细胞产生，并且每种ASC仅产生一种类型的mAb。因此，例如用于药物发现目的的抗体分析适用于单细胞分析。然而，当以常规分析形式的体积分析时，即使单独分析ASC而不是大量细胞群中，由于单一ASC仅产生少量抗体，抗体太稀，使其完全检测不到。
[0008]单细胞分析方法提供了增加鉴定新抗体的速度、通量和效率的方法。单细胞抗体表征方法的常用主题是使用小体积限制来增加分析灵敏度。一旦鉴定出目标细胞，就将它们回收以用于后续分析，包括其抗体基因的测序和/或可用于后续实验的更大量抗体的表达。用于筛选和选择来自单一细胞的抗体的小型化形式的实例包括基于板的方法(Czerkinsky等人.(1983).Journal of Immunological Methods 65(1
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2),pp.109
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121；Leslie等人.(1996).Faseb Journal 10(6),pp.346
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346)、微流体装置(Koster等人.(2008).Lab on a Chip 8(7),pp.1110
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1115；Mazutis等人.(2013).Nature Protocols8(5),pp.870
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891；Singhal等人.(2010).Analytical Chemistry 82(20),pp.8671
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8679)、微型印刷(microprinting)(Loveet等人.(2006).Nature Biotechnology 24(6),pp.703
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707)和开放微孔阵列(Jin等人.(2011).Nature Protocols 6(5),pp.668
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676；Wrammert等人.(2008).Nature 453(7195),pp.667
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U10)。
[0009]尽管存在用于单一ASC分析的技术，但是它们仍然受到低通量、灵敏度和可以进行的表征类型的困扰。本专利技术解决了本领域对于用于进行单一抗体分泌细胞分析的更稳健的装置、仪器和分析的需求。
[0010]专利技术概述
[0011]在一个方面，本专利技术涉及用于分析可归因于单一效应细胞的细胞外效应的平台。在一实施方案中，效应细胞是分泌生物因子例如抗体(ASC)的细胞。在一实施方案中，细胞外效应是细胞增殖、生长减少、细胞凋亡、裂解、分化、感染、结合(例如与细胞表面受体或表位结合)、形态学变化、信号级联的诱导或抑制、酶抑制、病毒抑制、细胞因子抑制或补体激活。在一实施方案中，平台是双组件微流体装置，其包括第一组件和第二组件，所述第一组件具有开放微室。在一个实施方案中，该装置是图4
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8之一中描绘的装置。
[0012]在一个方面，提供了用于鉴定包含显示细胞外效应的效应细胞的细胞群的方法。在该方面的一个实施方案中，在具有第一组件和第二组件的双组件微流体装置或者包括开放微室的单组件装置中分析一种或多个细胞群。该方法包括在位于微流体装置第一组件内的多个不同室中保留个体细胞群，各细胞群任选地包含一种或多种效应细胞，其中在单个室中保留个体细胞群。各室的纵横比(定义为高度比最小横向尺寸)≥约0.6，例如≥0.7，≥1或者≥1但≤约10。可选地，装置中各室的平均纵横比≥约0.6，例如≥0.7，≥1或者≥1但≤约10。多个开放室的一个或多个中的内容物还包含含有一种或多种读出颗粒的读出颗粒群。使微流体装置的第二组件与第一组件接触，以在两个组件之间产生可逆密封或可逆部分密封。第一组件和第二组件中的一个或两者的接触表面可以包括微尺度结构(如通道结构或室结构)，以使当进行这种密封时，装置第一组件的一个或多个开放室可以关闭或基本关闭。此外，当使第二组件与第一组件接触时，例如当通道结构存在于第二组件中时，两个或更多个开放室可以互连。该方法还包括在多个开放室中的一个或多个内孵育多个细胞群或其子集以及一种或多种读出颗粒或其子集；分析多个细胞群或其子集中细胞外效应的存在，其中读出颗粒群或其亚群提供细胞外效应的直接或间接读出；以及基于分析步骤的结果确定多个细胞群中的一种或多个细胞群的一种或多种效应细胞是否表现出细胞本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.鉴定产生细胞外效应的一种或多种抗体的方法，其包括：在各自平均纵横比(室高度：最小横向尺寸)≥0.6的多个不同开放室中保留各自包含10至100个细胞的多个细胞群，其中所述多个开放室存在于微流体装置的第一组件中，和其中所述第一组件被配置为与所述微流体装置的第二组件形成可逆密封，和其中所述多个细胞群中的至少一个个体细胞群包含一种或多种抗体分泌细胞(ASC)，和其中所述多个开放室或其子集中的单个开放室还包括包含一种或多种读出颗粒的读出颗粒群；孵育所述室中的内容物；分析多个室或其子集中细胞外效应的存在，所述细胞外效应由所述一种或多种ASC分泌的一种或多种抗体导致，其中所述读出颗粒群或其亚群提供所述细胞外效应的直接或间接读出；裂解所述细胞亚群以提供裂解的细胞亚群，扩增所述裂解的细胞群的每一个内的一种或多种核酸，对一种或多种扩增的核酸进行测序以鉴定编码一种或多种抗体基因或其一种或多种片段的一种或多种核酸，表达所述编码一种或多种抗体基因的一种或多种核酸以产生一种或多种重组抗体；在具有包含一种或多种读出颗粒的读出颗粒群的微流体装置中孵育所述一种或多种抗体；分析所述微流体装置中细胞外效应的存在，其中所述细胞外效应由所述一种或多种抗体导致；以及基于所述分析步骤的结果确定所述一种或多种抗体是否产生所述细胞外效应。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述读出颗粒群中的一种或多种包含一种或多种读出珠、一种或多种读出细胞或其组合。3.根据权利要求1所述的方法，其中用抗原或表位将所述读出颗粒群中的一种或多种功能化。...

【专利技术属性】
技术研发人员：卡尔，
申请(专利权)人：不列颠哥伦比亚大学，
类型：发明
国别省市：