基因DUYAO和JIEYAO在建立细胞筛选系统中的应用技术方案

本发明专利技术公开一种基因DUYAO和JIEYAO在建立细胞筛选系统中的应用，本发明专利技术提供的生殖隔离基因座及组成基因，培育RHS12位点亲和性水稻品系的策略，以及利用DUYAO和JIEYAO基因使转基因事件优势传递，快速纯合的方法对提高水稻杂种育性，加快水稻品种改良进程具有重要的应用价值。此外，通过对DUYAO和JIEYAO作用机制的阐明，以及两者对植物(例如水稻)细胞，真菌(例如酵母)细胞，动物(例如果蝇S2细胞)细胞同样具有毒性，解毒作用，拓宽了两基因的应用范围，对其它物种利用该基因进行遗传改良，医疗，生物制药等具有极高的科研和应用价值。物制药等具有极高的科研和应用价值。

【技术实现步骤摘要】
基因DUYAO和JIEYAO在建立细胞筛选系统中的应用
[0001]本申请为申请日为2022年8月30日，申请号为202211059979.0，专利技术名称为水稻生殖隔离基因座RHS12基因DUYAO和JIEYAO及其育种利用的中国专利技术专利的分案申请。


[0002]本专利技术属于植物基因工程
，具体涉及RHS12基因座的鉴定，RHS12基因座组成基因DUYAO和JIEYAO的克隆，DUYAO和JIEYAO两个基因在植物(水稻)，真菌(酵母)和动物(果蝇)中的功能验证，以及在水稻育种中的利用。
技术背景
[0003]水稻是全世界一半人口，中国60％人口的主粮，因此提高水稻产量对确保粮食安全具有重要的意义。水稻种间，亚种间存在强大的杂种优势，籼粳杂交具有能提高水稻约30％产量的潜力(Qian,2016)。此外，野生稻一些优良的农艺性状，如耐逆性、抗虫性、抗病性等导入到栽培稻中能维持栽培稻产量的稳定(徐鹏,2005)。然而，种间，亚种间存在的生殖隔离严重影响了水稻杂种优势的利用，即存在的杂种不育基因一方面严重影响了水稻的产量提高，另一方面严重限制了种间或亚种间有利基因的交流和聚合(Ouyang and Zhang,2013)。
[0004]为了克隆杂种不育基因，解析杂种不育机理，以期更好得利用杂种优势，几十个控制杂种不育的位点已经被鉴定。根据导致的性状不同，这些基因被分为杂种雄配子败育基因，例如Sa,Sb,Sc,Sd,Se,S24(Zhao et al.,2011；Li et al.,2006,2008；Long et al.,2008；Shen et al.,2017；朱文银et al.,2008)等。还有一些是雌配子败育基因，例如S1,S5,S7,S29,S31(Zhao et al.,2007；Xie et al.,2019；Yang et al.,2012；Yu et al.,2016；Zhu et al.,2005)等。然而，目前仅有Sa,S5,S1,Sc,qHMS7(Long et al.,2008；Shen et al.,2017；Xie et al.,2019；Yang et al.,2012；Yu et al.,2018)等少数几个座位的基因被克隆，尚不能解决杂种不育问题，因此需要鉴定和克隆更多的杂种不育基因。在克隆杂种不育基因后，就可以去筛选或创造广亲和材料。所谓的广亲和材料是指粳稻携带S
‑
j型基因，籼稻携带S
‑
i型等位基因，而携带中性基因S
‑
n的即为广亲和材料。广亲和材料和粳稻或者籼稻杂交育性都正常。此外，目前已克隆的水稻杂种不育基因仅限于对水稻生殖细胞(配子)起作用，其是否对体细胞甚至水稻以外的物种起作用值得深入的研究和具有重要的意义。

技术实现思路

[0005]本专利技术目的之一在于提供水稻种间、籼粳亚种间、粳稻和籼稻品种间均广泛存在的生殖隔离位点RHS12。
[0006]本专利技术目的之二在于提供组成RHS12位点的基因：DUYAO和JIEYAO。
[0007]本专利技术目的之三在于提供DUYAO和JIEYAO基因所编码的蛋白。
[0008]本专利技术目的之四在于提供DUYAO和JIEYAO基因在水稻育种中培育育性亲和性水稻
品系的应用。
[0009]本专利技术所述目的的具体技术方案如下：
[0010]本专利技术所述的生殖隔离位点RHS12位于水稻第12号染色体短臂，具体位置为标记DK24和TGR4之间30.8kb的区间范围内。
[0011]其中分子标记DK24的序列为：
[0012]DK24
‑
F TGTAATTGCAAGAATGGGCC
[0013]DK24
‑
R CTCCGTTCGTCCGTAAAGTA。
[0014]分子标记TGR4的序列为：
[0015]TGR4
‑
F ATTCGAATAGCCGTGCCCGT
[0016]TGR4
‑
R CCAACCAACCCACCTGAACT。
[0017]本专利技术所发现的RHS12基因座能决定种间，籼粳亚种间，籼稻或粳稻品种间杂交是否会产生生殖隔离，具体表现为发生花粉或雌配子败育。
[0018]本专利技术克隆了组成RHS12基因座的两个基因DUYAO和JIEYAO，其中基因DUYAO核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，蛋白序列如SEQ ID NO.2所示；基因JIEYAO核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，蛋白序列如SEQ ID NO.4所示。
[0019]本专利技术还阐明了DUYAO和JIEYAO两个基因引起RHS12位点生殖隔离的遗传和分子机制。DUYAO蛋白通过与OsCOX11互作产生细胞毒性，引起细胞及配子死亡；而JIEYAO蛋白通过与DUYAO互作，改变DUYAO蛋白的线粒体定位，并使其降解，进而解除毒性，细胞及配子存活。
[0020]本专利技术还提供了上述培育的育性亲和性品系在水稻育种的利用，具体应用方法为将DUYAO基因无功能而JIEYAO基因有功能的育性亲和性品系与其它任何品种杂交，培育没有RHS12位点生殖隔离效应的杂交材料，用于水稻育种。本专利技术所述的DUYAO基因无功能是指DUYAO基因没有正常表达的情况，例如基因DUYAO被敲除或被沉默。培育的没有RHS12位点生殖隔离效应的杂交材料为育性正常的杂交材料，也就是RHS12位点不引起花粉或胚囊育性降低的材料，用于水稻育种。
[0021]本专利技术还提供了培育水稻育性亲和性品系的策略，具体为破坏目标水稻品种中的DUYAO基因或者将JIEYAO基因转入目标水稻品种中。破坏基因DUYAO的方法可以采用本领域常用的方法，例如通过但不局限于CRISPR/Cas9技术，对DUYAO基因进行突变，使其丧失功能。
[0022]本专利技术还提供培养杂种不育生物品系的策略，其特征在于，具体为将权利要求2所述的基因DUYAO和基因JIEYAO一起转入目标生物中。
[0023]本专利技术还提供一种打破水稻生殖隔离的方法，破坏目标生物中的基因DUYAO或者将基因JIEYAO转入目标水稻品种中。
[0024]本专利技术还提供一种建立生物生殖隔离的方法，其特征在于，将基因DUYAO和基因JIEYAO一起转入目标生物中。
[0025]本专利技术所述的生物为含有基因座RHS12的植物，和不含有RHS12位点的真菌或动物；更优选的为水稻、酵母或果蝇。
[0026]本专利技术还提供了一种通过转基因将目的基因进行优势传递，快速纯合的策略。具体应用方法为将DUYAO和JIEYAO两个基因组成一个元件，需要转基因的基因与该元件串联
组成一个新的元件，该单拷贝新元件能接近100％传递到T1代，而且接近50％的T1代为转基因纯合型。
[0027]本专利技术还提供了DUYAO和JIEYAO两个基因在体细胞(以水稻为例)中的应用。具体方法为将DUYAO基因在水稻愈伤细胞表本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.SEQ ID NO.1所示基因DUYAO或SEQ ID NO.2所示基因JIEYAO在建立细胞筛选系统中的应用，其特征在于，具体为将SEQ ID NO.1所示基因DUYAO转入需淘汰的细胞，获得不能生长或增殖缓慢的细胞；或者将SEQ ID NO.2所示基因JIEYAO转入需保留的具有基因...

【专利技术属性】
技术研发人员：万建民，王超龙，王建，陆佳雨，赵志刚，江玲，刘喜，刘世家，田云录，陈亮明，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：