ZmDPP1及其编码蛋白在玉米育性控制中的应用制造技术

本发明专利技术公开了ZmDPP1及其编码蛋白在玉米育性控制中的应用。本发明专利技术采用EMS诱变获得一个玉米雄性不育突变体ddp1，通过图位克隆鉴定出一个控制玉米雄花发育的基因ZmDPP1。本发明专利技术通过CRISPR/Cas9基因编辑技术在野生型玉米中定点突变该基因，创制出3个ddp1的等位玉米雄性不育突变体，该突变体玉米雄花完全败育，通过后代筛选，可以得到不含转基因成分的不育突变体，进而应用于玉米不育化育种和制种。本发明专利技术还针对dpp1的三个等位雄性不育突变体设计了功能分子标记，在玉米雄性不育系培育、不育化杂交制种和分子标记辅助选择中具有重要的应用价值。应用价值。应用价值。

【技术实现步骤摘要】
ZmDPP1及其编码蛋白在玉米育性控制中的应用


[0001]本专利技术属于植物生物技术育种领域，涉及控制育性的ZmDPP1基因和其不育突变基因dpp1，以及ZmDPP1和其编码蛋白在玉米育性控制中的应用。

技术介绍

[0002]玉米（Zea mays L.）属禾本科植物，是重要的粮食作物之一，玉米及其副产品均可作为饲料原料的重要来源。此外，玉米籽粒可作为重要的工业原料，用于生产玉米胚芽油、玉米淀粉等，而且玉米在生物医药和工业酒精等工业生产中也具有重要作用。杂种优势是生物界普遍存在的遗传现象，是指植物不同品系之间进行杂交所得到的杂交后代在一种或多种性状上优于其纯合的父本和母本的现象。植物杂交后代的产量显著提高、生产繁殖能力增强，或表现在抗虫害、抗病性、抗逆性等方面的提高，杂种优势已被广泛应用于植物育种中，以提高农作物的产量。
[0003]早在1924年，玉米商业化的杂交种就已产生，由于玉米是雌雄同株异花作物，在玉米杂交育种和杂交种生产过程中均需对母本进行去雄。目前，母本去雄的方法主要有四种：人工去雄、机械去雄、化学杀雄和雄性不育技术。人工去雄导致制种成本的大幅度提高，同时去雄不及时；机械去雄将对植株造成物理性伤害，不利于植株生长发育；化学杀雄对植株自身有着较大的毒害作用，同时存在去雄不彻底的情况。雄性不育（male sterility, MS），是指在植物生长过程中，植物营养生殖长阶段正常发育，但在有性生殖发育阶段中雄性生殖器官发育异常，其无法产生具有正常功能的花粉而导致无法授粉结实。具有雄性不育表型的植株由于自身无法产生具有正常功能的花粉，因此，在杂交制种中可作为母本，从而降低了人工去雄的成本，同时有效地保证了杂交种子的纯度，此项技术对环境和植物都无明显副作用。当前，利用雄性不育技术进行玉米杂交育种和制种，是有效提高玉米杂种优势利用率和产量的重要途径。
[0004]利用图位克隆技术和CRISPR/Cas9基因编辑技术相结合，快速鉴定出新的玉米雄性不育基因，并通过系统的细胞学观察雄花发育的形态变化，既可以了解雄花发育机制，同时可以快速丰富玉米核雄性不育基因和不育材料资源，从而促进玉米不育化育种和制种的推广和应用。

技术实现思路

[0005]针对现有技术的不足，本专利技术的目的是提供ZmDPP1及其编码蛋白在玉米育性控制中的应用，可以用来创制雄性不育系，应用于玉米杂交育种和制种，提高玉米杂种优势利用效率，最终提高玉米单产。
[0006]为实现上述目的，本专利技术提供了一种玉米雄性育性基因ZmDPP1及其不育突变基因dpp1，其特征在于，所述玉米雄性育性基因ZmDPP1核苷酸序列为SEQ ID NO.1，其编码蛋白ZmDPP1序列为SEQ ID NO.2；玉米雄性不育突变基因dpp1，其特征在于，该突变是由野生型ZmDPP1基因第2个外显子的+247位缺失1个碱基（T）引起，该突变造成ZmDPP1蛋白翻译提前
终止，蛋白长度只有71个氨基酸，这导致含有该突变核苷酸序列dpp1突变体虽能正常抽雄，但花药干瘪，花粉败育，最终表现为完全雄性不育表型；所述突变基因dpp1的全长DNA和氨基酸序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。
[0007]在另一方面，本专利技术还提供了ZmDPP1基因或ZmDPP1蛋白在培育雄性不育植物中的应用；所述的应用为通过基因编辑或RNA干扰抑制ZmDPP1基因的表达和/或活性获得玉米雄性不育系；上述应用中所述的ZmDPP1基因为序列表中SEQ ID NO.1所示的DNA分子，ZmDPP1蛋白是由序列表中SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质。
[0008]在另一方面，本专利技术还提供了一种创制玉米dpp1等位雄性不育突变体的方法，其特征在于，所述方法为基于CRISPR/Cas9的基因编辑方法，对玉米基因组中的ZmDPP1基因进行定点突变，进而使其育性功能丧失，得到不同突变类型的玉米雄性不育系。
[0009]上述应用中所述CRISPR
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Cas9系统表达Cas9蛋白的基因和sgRNA的基因，所述sgRNA的靶序列如序列表中SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示，均位于ZmDPP1基因的第1个外显子区域。
[0010]进一步本专利技术提供了玉米dpp1的三种等位雄性不育突变体，其特征在于，dpp1等位突变体包括ZmDPP1
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Cas9
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1、ZmDPP1
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Cas9
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2和ZmDPP1
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Cas9
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3；其中ZmDPP1
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Cas9
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1在第1个外显子56 bp
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127 bp处缺失72个碱基（TTCTCATCCTATGCTCGTCCCTCCCTTCCCTCGCCGCCGCATACCGCCCAGGCGACATCGTCCCGATGCTCC）；ZmDPP1
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Cas9
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2在第1个外显子47 bp
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124 bp处缺失78个碱基（CCGCCCTCCTTCTCATCCTATGCTCGTCCCTCCCTTCCCTCGCCGCCGCATACCGCCCAGGCGACATCGTCCCGATGC）；ZmDPP1
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Cas9
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3在第1个外显子36 bp处插入31个碱基（ATACCGCCCAGGCGACATCGTCCAGGCGACA）和37 bp
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52 bp处缺失16个碱基（GGCGTCCTCCCCGCCC）和112 bp
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123 bp处缺失12个碱基（ATCGTCCCGATG）。
[0011]本专利技术还提供了三种玉米雄性不育突变体ZmDPP1
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Cas9
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1、ZmDPP1
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Cas9
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2和ZmDPP1
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Cas9
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3的功能标记。
[0012]其中所述ZmDPP1
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Cas9
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1突变体功能分子标记引物ZmDPP1
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F1和ZmDPP1
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R1的序列分别如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示，该功能标记能同时区分野生型ZmDPP1基因和dpp1
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Cas9
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1突变型基因。
[0013]所述ZmDPP1
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Cas9
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2突变体功能分子标记引物ZmDPP1
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F2和ZmDPP1
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R2的序列分别如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示，该功能标记能同时区分野生型ZmDPP1基因和dpp1
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Cas9
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2突变型基因。
[0014]所述ZmDPP1
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Cas9本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种玉米雄性育性基因ZmDPP1，其特征在于，该基因位于玉米6号染色体，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1，其编码蛋白序列为SEQ ID NO.2。2.一种玉米雄性不育突变基因dpp1，其特征在于，所述不育突变基因dpp1由权利要求1所述玉米雄性育性基因ZmDPP1第2个外显子的+247位缺失1个碱基T引起，所述突变基因dpp1的全长DNA序列为SEQ ID NO.3，其编码氨基酸序列为SEQ ID NO.4。3.ZmDPP1基因在控制玉米雄性生殖发育中的应用，其特征在于，抑制玉米中ZmDPP1基因的表达和/或活性，选择玉米雄性不育的植株；所述ZmDPP1基因为权利要求1所述玉米雄性育性基因ZmDPP1。4.根据权利要求3所述ZmDPP1基因在控制玉米雄性生殖发育中的应用，其特征在于，抑制基因表达和/或活性的方法包括基因编辑、RNA干扰中任一种。5.根据权利要求4所述ZmDPP1基因在控制玉米雄性生殖发育中的应用，其特征在于，所述基因编辑采用CRISPR/Cas9方法。6.根据权利要求5所述ZmDPP1基因在控制玉米雄性生殖发育中的应用，其特征在于，所述CRISPR/Cas9方法包括：在所述基因第一外显子处设计CRISPR/Cas9载体靶点，所述靶点的DNA序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。7.一种创制玉米dpp1雄性不育系的方法，其特征在于，所述方法为权利要求6所述的CRISPR/Cas9基因编辑方法，通过对玉米基因组中的ZmDPP1基因进行定点突变，得到不同突变类型的玉米等位雄性不育突变体。8.根据权利要求7所述创制玉米dpp1雄性不育系的方法，其特征在于，所述玉米dpp1雄性不育系包括ZmDPP1
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Cas9
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1，ZmDPP1
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Cas9
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2和ZmDPP1
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Cas9
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3等3个等位雄性不育突变体；其中，ZmDPP1
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Cas9
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1在第1个外显子56 bp
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【专利技术属性】
技术研发人员：万向元，安学丽，马斌，赵丽娜，张少伟，张娟，李紫文，田甜，李焕改，刘欣洁，
申请(专利权)人：北京科技大学北京中智生物农业国际研究院，
类型：发明
国别省市：